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蔗糖合成酶(合成方向;SS-Ⅱ)試劑盒說明書

閱讀:437      發(fā)布時間:2023-06-01
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蔗糖合成酶(合成方向;SS-試劑盒說明書

                                   微量法100/48

 

 

   意 :正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定

測定意義

蔗糖是源(葉片等)光合產(chǎn)物向"器官運輸?shù)闹饕螒B(tài)。蔗糖合成酶(Sucrose Synthase, EC 2.4.1.13)是雙向反應酶,既可催化蔗糖合成又可催化蔗糖分解,是蔗糖代謝的關(guān)鍵酶之一。研究其合成方向SS-的活性對于植物蔗糖合成具有重要意義。

 

測定原理

SS-催化游離果糖與葡萄糖供體UDPG反應生成蔗糖,蔗糖與間苯二酚反應可呈現(xiàn)顏色變化,在480nm下有特征吸收峰,酶活力大小與顏色的深淺成正比。

 

需自備的儀器和用品

可見分光光度計/酶標儀、水浴鍋、離心機、移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰

 

試劑的組成和配制

提取液液體100mL×1瓶,4保存;

試劑一:液體2.5mL×1瓶,-20保存;

試劑二:1000μg/mL蔗糖溶液10mL×1瓶,4保存;

試劑三:液體2mL×1瓶,4保存

試劑四:液體25mL×1瓶,4保存;

試劑五:液體6mL×1瓶,4避光保存;

 

樣品測定的準備:

按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)15~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液),進行冰浴勻漿。8000g 4離心10min,取上清,置冰上待測。

 

測定步驟

1、   分光光度計或酶標儀預熱30min以上,調(diào)節(jié)波長至480nm,蒸餾水調(diào)零。

2、   樣本測定,(在EP管中依次加入下列試劑):

試劑名稱μL

測定管

對照管

標準管

空白管

樣本

10

10



蒸餾水


45

45

55

試劑二



10


試劑一

45




混勻,25準確水浴10min

 試劑三

15

15

15

15

 

沸水浴中煮沸10min左右(蓋緊,以防止水分散失),冷卻

試劑四

     210

     210

210

210

試劑五

     60

      60

60

60

混勻,沸水浴30min,冷卻后,取200μL 至微量石英比色皿或96孔板中,480nm下測定各管吸光值。標準管和空白管只要做一管。每個測定管需要設(shè)一個對照管。

 

SS-活性計算

1、按照蛋白濃度計算

單位定義:每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1μg 蔗糖定義為一個酶活力單位。

SS-活性(μg /min/mg prot)= C標準管×V1×A測定管-A對照管)÷A標準管-A空白管)÷(V1×Cpr)÷T=100×A測定管-A對照管)÷A標準管-A空白管)÷Cpr

2、按照樣本鮮重計算

單位定義:每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1μg 蔗糖定義為一個酶活力單位。

SS-活性(μg /min/g鮮重) = C標準管×V1×A測定管-A對照管)÷A標準管-A空白管)÷(W×V1÷V2)÷T=100×A測定管-A對照管)÷A標準管-A空白管)÷W

C標準管:標準管濃度,1000μg/mL;V1:加入反應體系中樣本體積,0.01mL; V2:加入提取液體積,1mL;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本鮮重,gT :反應時間:10min。

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優(yōu)利科(上海)生命科學有限公司

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