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DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3B(DNMT3B)真核蛋白操作步驟
閱讀：822 發(fā)布時(shí)間：2023-7-12DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3B(DNMT3B)真核蛋白操作步驟：
Ⅰ 實(shí)體組織蛋白的提取
1． 在每1mL 冷Lysis Buffer加入10 μL磷酸酶抑制劑， 1 μL蛋白酶抑制劑和 5μL 100mM PMSF，混勻。冰上保存數(shù)分鐘待用。
2． 每100mg固體組織置于培養(yǎng)皿中，剪碎成3mm×3mm左右的小塊，加入0.5～1 mL冷 Lysis Buffer，玻璃勻漿器上下手動(dòng)勻漿15次，注意低溫操作；
3． 取組織勻漿液轉(zhuǎn)移到1.5mL預(yù)冷的離心管，離心10000轉(zhuǎn)/分，4℃離心5 min；
4． 取上清轉(zhuǎn)移至新的預(yù)冷的離心管中，即為全蛋白提取物，蛋白定量（Bradford法、BCA法）；
5． 分裝保存于-70℃,避免反復(fù)凍融。
Ⅱ 培養(yǎng)細(xì)胞蛋白提取
1． 貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞，吸去培養(yǎng)基后，加入10mL/150mm培養(yǎng)板的冷PBS洗兩次，每次振搖數(shù)次以盡量去除培養(yǎng)液；
2． 懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞或用細(xì)胞刮子刮下的貼壁細(xì)胞，將細(xì)胞及培養(yǎng)液移至離心管中， 1000轉(zhuǎn)/分離心10 min，再用10mL/150mm培養(yǎng)板的冷PBS，1000轉(zhuǎn)/分離心5 min洗兩次；
3． 在每 1mL冷 Lysis Buffer加入10μL磷酸酶抑制劑， 1μL蛋白酶抑制劑和5μL 100mM PMSF，混勻。冰上保存數(shù)分鐘待用。
4． 細(xì)胞洗滌后，轉(zhuǎn)至新的預(yù)冷的離心管中，加入上述配制好的冷Lysis Buffer，加入量如下表所示：
細(xì)胞數(shù)量
Lysis Buffer加入量
107個(gè)
0.5 mL～1 mL
5×106個(gè)
0.2 mL～0.5 mL
5．置于4℃搖床平臺(tái)上，溫和振蕩15 min；
6． 14,000rpm，4℃離心15min，取上清為全蛋白提取物, 蛋白定量（Bradford法、BCA法）；
7． 分裝保存于-70℃,避免反復(fù)凍融
DNA堿性膠上樣液（1.5 mL）
DNA堿性膠上樣液（10 mL)
DNA尿素-PAGE上樣液（1.5 mL）
DNA尿素-PAGE上樣液（10 mL）
DNA上樣液（紅），6×（非甘油）（見(jiàn)關(guān)聯(lián)產(chǎn)品）
DNA上樣液（藍(lán)），6×（非甘油）（見(jiàn)關(guān)聯(lián)產(chǎn)品）
DNA上樣液，6×（紅）
DNA上樣液，6×（藍(lán)）
miRNA尿素-PAGE上樣液（1.5 mL）
miRNA尿素-PAGE上樣液（10 mL）
三合一RNA上樣液（A型）
三合一RNA上樣液（B型）
核酸染料
SYBR Green Ⅱ核酸染料
超快核酸銀染試劑盒
電泳級(jí)SYBR Green I
電泳級(jí)耐熱型SYBR染料
綠如藍(lán)核酸染料（UV）（0.5 mL）
綠如藍(lán)核酸染料（UV）（1.5 mL）
綠如藍(lán)核酸染料（可見(jiàn)光型）
溴化乙錠干粉
溴化乙錠清除劑（EB清除劑）
溴化乙錠溶液（1.5 mL）