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【概述】

食品貿(mào)易的長足發(fā)展使各種果蔬得以全年供應。不過，這也對努力確保食品供應鏈安全的食品安全監(jiān)管機構提出了全新的挑戰(zhàn)，特別是各地可能使用的數(shù)百種農(nóng)藥的安全問題。為此，歐盟制定了為嚴格的農(nóng)殘法規(guī)：2008年，歐盟頒布EC No. 396/20051法規(guī)，將尚未設置實質性大殘留*（MRL）的所有農(nóng)藥/商品組合的默認MRL設置為10μg/Kg；繼此，2009年，農(nóng)藥安全審查EU 91/414/EEC2指令使約250種農(nóng)藥得以批準，并將所有其他農(nóng)藥的容許殘留量設置為默認限值（10μg/Kg）；近，新版“食品飼料中農(nóng)殘分析的質量控制和方法確認的指導文件SANTE/11945/2015”于2016年年初正式實施3。該指導文件介紹了方法驗證和分析質量控制（AQC）的要求，以支持在農(nóng)殘*控制框架內(nèi)報告并用于大殘留*（MRLs）合規(guī)性檢查、執(zhí)法行動或消費者暴露評估的數(shù)據(jù)的有效性。該文件預期供歐洲*控制實驗室使用，而實際上被廣泛用于世界各地的農(nóng)藥實驗室。嚴格的要求的實施為致力于提供具有成本競爭優(yōu)勢的服務的檢測實驗室提出了巨大挑戰(zhàn)。

 

農(nóng)殘測試通常要求使用結合三重四極桿質譜儀的液相和氣相色譜技術進行檢測。這些分析技術必須符合選擇性監(jiān)測的化合物范圍和靈敏度的要求，但是于檢測那些在數(shù)據(jù)采集時進行測量的目標農(nóng)藥，故需謹慎的方法優(yōu)化和管理，以確保所選離子監(jiān)測窗口可行。近年來，高分辨率Orbitrap質譜儀憑借其附加逐步添加逐步成為MS/MS技術的替代技術。

使用高分辨率質譜儀（HRMS）時，默認采集模式為非靶向（全掃描）模式，便于管理和在單次進樣中監(jiān)測無限數(shù)量的農(nóng)藥。此外，全掃描數(shù)據(jù)分析還提供對定性識別點的補充（如質譜圖檢索）的訪問，使樣品的回顧性分析成為可能，以另行檢索在數(shù)據(jù)采集時未予考慮的新興農(nóng)藥或其他雜質。

 

在本研究中，按照 SANTE/11945/2015指導文件，在全掃描模式下，針對果蔬中 GC 可測農(nóng)藥的常規(guī)分析，對Thermo ScientificTM Exactive GC OrbitrapTM質譜儀的定量特性進行了評估。Exactive GC-MS系統(tǒng)提供高達 60,000 （m/z 200 時 FWHM） 的常規(guī)高質量分辨率和適合 GC 峰的掃描速度，促進復雜基質成分中痕量化合物的檢測。

【實驗/設備條件】

表1. GC條件。

表2.質譜儀條件

【實驗/操作方法】

從當?shù)爻匈徣胛骷t柿、韭蔥和橙子，按照檸檬酸鹽緩沖體系的QuEChERS方法進行前處理，將10 mL乙腈加入10 g均質樣品中，振蕩4分鐘。加入鹽混合物，將離心管振蕩4分鐘，再以3700 rpm的速度離心5分鐘。將上清液（5 mL）轉移到內(nèi)含硫酸鎂和125 mg PSA的15 mL PTFE離心管中。在渦旋振蕩器中振蕩提取物，如上進行離心。終的乙腈提取物（1g/mL）用作空白基質。制備校準液系列時，取100μl乙腈空白基質在氮氣流下干燥。在含有適當濃度農(nóng)藥的100μl乙酸乙酯中對樣品進行復溶。

在西紅柿、韭蔥和橙子體系中，配制51種農(nóng)藥的三個校準液系列，濃度為0.5、1、2、5、10、20、50、100、200

和500μg/Kg。這51種農(nóng)藥涵蓋了范圍廣泛的化學農(nóng)藥類別，使用這三種基質共產(chǎn)生153種農(nóng)藥/基質組合。評估化合物線性時，先分析與校準液系列匹配的基質，再對每種基質的10μg/Kg樣品進行10次重復進樣。評估一段時間內(nèi)的可重復性，再將同一樣品瓶中10μg/Kg的西紅柿標樣進樣100次。

【實驗結果/結論】

本研究旨在根據(jù)SANTE指令要求評估Exactive GC系統(tǒng)在三種不同樣品基質中對農(nóng)藥進行常規(guī)分析的性能。所選樣品

（西紅柿、韭蔥和橙子）呈現(xiàn)了常規(guī)測試中常見的簡單和復雜基質。為加以說明，圖1顯示了不同樣品復雜度的總離子色譜圖（帶固定Y軸）。韭蔥基質顯然是復雜的基質，需以高質量分辨率將目標分析物從化學噪聲背景中提取出來。

 

針對常規(guī)農(nóng)藥篩查，HRMS處理軟件需快速、準確且可根據(jù)不同的需求進行定制。TraceFinder可滿足所有這些要求，并在5分鐘內(nèi)處理各批校準標樣和10次復制樣品。在TraceFinder中，結果以表格格式呈現(xiàn)給用戶，并使用數(shù)據(jù)標記來快速識別陽性農(nóng)藥和所滿足的標準。靈活的報告選項意味著數(shù)據(jù)可導出到其他軟件或直接從TraceFinder進行結果的報告。

 

根據(jù)指導要求進行確認

該分析的一個目的是確定全部三種基質中所有農(nóng)藥的檢出限（LOD）、確認限（LOI）、線性范圍和峰面積重復性。盡管SANTE指導文件中并未討論LOD，但由于依據(jù)定量離子得到的的檢測限用于形成終的校準系列，并終用于確定樣品中檢測到農(nóng)藥的濃度，因此掌握定量離子的檢出限十分有益。通過評估基質匹配校準系列和每種基質10μg/Kg水平的農(nóng)藥的重復進樣評估LOD。LOD定義為農(nóng)藥主要定量離子的提取離子色譜圖（XIC）中存在S/N（峰到峰）＞3的峰。LOI的確定應遵SANTE/11945/2015指導文件。為進行正確確認，應滿足以下要求：

圖1. Y軸固定于4.0 e9的西紅柿、韭蔥和橙子提取物的全掃描總離子色譜圖（TIC），顯示本研究中所用樣品基質的復雜性。

(i)每種農(nóng)藥檢出兩種離子且質量度< 5 ppm，峰S/N > 3

(ii)保留時間容差±0.1 min（與同一序列的標準品相比）

(iii)離子比率在同一序列標準品的平均離子比率的±30%以內(nèi)。

(iv)可選項：為使鑒定達到更高的置信度，可使用其它標準，如全掃描質譜、同位素模式匹配及其他碎片離子。

 

遵循監(jiān)管標準（LOI）對所有濃度小于等于5μg/Kg（表3-5）的基質中除韭蔥中百菌清以外的所有農(nóng)藥進行鑒定。百菌清因與韭蔥基質中的硫化合物相互作用而發(fā)生損失。5153種農(nóng)藥/基質組合（79%）中的多數(shù)具有≤  2μg/Kg的確認限。圖2為計算出的檢出限匯總，圖中顯示93%的農(nóng)藥/基質組合的檢出限≤ 1μg/Kg。多個鑒定點和遠低于MRL的檢出限增加了鑒定的置信度并降低了假陰性和假陽性的結果。將電子轟擊電離（EI）與全掃描采集相結合能夠用多定性

離子鑒定農(nóng)藥。

圖2.農(nóng)藥/基質組合的檢出限（LOD）和確認限（LOI）

Exactive GC系統(tǒng)生成標準的EI質譜圖，重現(xiàn)性高，易于庫檢索（低分辨或高分辨率MS數(shù)據(jù)庫），讓基于質譜圖檢索進行的農(nóng)藥檢測和鑒定更加方便。由于Orbitrap分析儀的質量度足夠高，化學式可輕松的與碎片離子質量數(shù)吻合，故可快速添加此結果至化合物數(shù)據(jù)庫中。

定量可靠

在0.5-500μg/Kg的濃度范圍內(nèi)，使用基質匹配標準品進行定量線性評估。在所有情況下，在三種基質中，從檢出限到500μg/Kg，每種農(nóng)藥的相關系數(shù)（R2）均> 0.99。圖3為TraceFinder瀏覽器顯示的撲滅津實例?；蚴芊治鑫镂降挠绊?，苯銹啶的濃度線性至200μg/Kg，屬于個別例外。定量取決于多項因素，其中一項因素為采集速度，采集速度應足夠快速，以能在色譜峰中提供至少12個點。Exactive GC系統(tǒng)的分辨率達60,000，掃描速度約7 Hz。圖4為在6秒峰上有38個點的乙酯殺螨醇峰。

圖3.顯示鑒定結果呈陽性的農(nóng)藥、提取離子色譜圖及校準圖的TraceFinder瀏覽器（以撲滅津為例）。在校準范圍內(nèi)和10μg/kg重復樣品樣中sub-ppm的撲滅津的質量度。當超出規(guī)定時提示并標記鑒定標準信息。

表3.韭蔥中農(nóng)藥的方法性能總結。*韭蔥中降解的百菌清。

 

圖4.在分辨率為60,000（m/z 200時FWHM）的條件下，從添加濃度為10μg/Kg的韭蔥樣品中獲得的乙酯殺螨醇（m/z 251.0025±5 ppm質量窗口）的提取離子色譜圖。結果顯示~38次掃描/峰（峰寬6s）。每次掃描所達到的度低于1 ppm（每第三次掃描標記一次）。峰上的平均RMS質量差異為0.6 PPM。

圖5顯示在所有三種基質中重復進樣10次（濃度為10μg/Kg）的結果。所檢測到的農(nóng)藥的%RSD小于10%，遠低于SANTE指導文件所規(guī)定閾值（20%），表明在分辨率為60k條件下以全掃描模式所運行的Exactive GC系統(tǒng)達到了可靠分析農(nóng)藥所需的選擇性和靈敏度，遠低于各自的MRL。

圖5.所研究的三種基質中，每種農(nóng)藥在濃度為10μg/Kg（n=10）條件下的峰面積重復性（%RSD）。圖中還顯示SANTE指導文件的閾值為20%。

表4.橙子中農(nóng)藥的方法性能結果總結。* LOD-200μg/Kg

可靠的質量度

當檢測復雜樣品基質中的低濃度農(nóng)藥時，獲取可靠的質量數(shù)測定至關重要。在數(shù)據(jù)處理過程中，較低的質量誤差可在使用窄質量提取窗時確保高選擇性并有助于確保陽性檢測的可靠性。通過辨別基質干擾和目標分析物離子的高質量分辨力，使用Exactive GC系統(tǒng)時可達到低質量誤差。當分辨率不足時，兩個離子質譜圖重疊，造成目標化合物的讀出質量數(shù)產(chǎn)生偏離。圖6為在分辨率分別為15K、30K、60K條件下，對濃度為10μg/Kg的韭蔥基質標準品所做的分析。

質譜圖顯示二甲嘧菌胺的定量離子和產(chǎn)生干擾的質量相近的基質離子。在 15 K 和 30 K 條件下，未能分離二甲嘧菌胺離子，致使質量度較差，分別為 10.1 ppm和 6.3 ppm。但在 60 K 條件下，離子被*分類，達到預期質量度（小于1 ppm）。如達不到此質量分辨率，則此農(nóng)藥將達不到 SANTE 鑒定標準（＜ 5 ppm）且會出現(xiàn)假陰性結果（報告為“未檢測到”）。這支持了先前的報告，即在某些情況下，為確保高選擇性，分辨率需達到 60 K（200 m/z）。6

 

圖6.在15K、30K和60K的分辨率條件下，分辨率對添加濃度為10μg/Kg的韭蔥樣品中二甲嘧菌胺診斷離子質量度的影響。在15K和30K條件下，二甲嘧菌胺離子未從干擾基質離子中分離出來，致使質量度分配較差。

表5.西紅柿中農(nóng)藥的方法性能結果總結。

 

對51種農(nóng)藥的LOI處進行質量度評估，評估結果如圖7所示。所有分析物的質量誤差值均未超過1.2 ppm，遠低于指導文件的限值（5 ppm），在的選擇性檢測中，提供高置信度。

 

在農(nóng)藥分析中，儀器應能夠在整個可能遇到的分析物濃度范圍內(nèi)保持質量度，這點也非常重要。如因檢測器飽和而造成高濃度農(nóng)藥超標，則無法接受。在Exactive GC系統(tǒng)中，通過使用自動增益控制（AGC）來控制離子的進入數(shù)量，從而保護Orbitrap分析儀免于飽和。這確保了無論濃度高低，均能保持良好的質量度。如圖8所示，當韭蔥基質中的濃度范圍為0.5～500μg/Kg時，四種農(nóng)藥的質量度始終< 1 ppm。

 圖7.三種基質中每種農(nóng)藥在LOI處的質量差異測定值

圖8.韭蔥中四種農(nóng)藥在0.5-500μg/mL的濃度范圍內(nèi)的質量度測定值。質量度保持在

1 ppm以下。

 

實際性能

在高通量常規(guī)農(nóng)藥分析實驗室，質譜儀始終處于持續(xù)運行的狀態(tài)，因此儀器在相對較長時間內(nèi)保持同等性能水平非常重要。為評估Exactive GC系統(tǒng)在較長時間內(nèi)的性能，在同一樣品瓶中對濃度為10μg/Kg的西紅柿提取物重復進樣100次。開始分析前，安裝一個新的進樣口襯管，調(diào)諧離子源并校準MS。

在66小時的連續(xù)運行中未進行其他干預。結果表明，從進樣器到MS，該系統(tǒng)性能持續(xù)穩(wěn)定。圖9顯示經(jīng)過100次進樣，濃度為10μg/Kg的西紅柿中的六氯苯、乙烯菌核利和氟樂靈的峰面積響應，其中RSD%分別為5.3%、4.6%和3.8%。此外，在未做進一步質量校準的情況下，分析持續(xù)時間內(nèi)的質量度穩(wěn)定性< 1.2 ppm（99% ≤1 ppm）（圖10）。

圖9.添加濃度為10μg/Kg的西紅柿提取物的100次重復進樣。結果表明，在66小時的連續(xù)運行中均保持良好的靈敏度。

圖10.濃度為10μg/Kg的西紅柿提取物中六氯苯、乙烯菌核利和氟樂靈100次進樣的質量度(ppm)。在使用同一襯管且不進一步校正質譜儀或調(diào)諧離子源時獲得的數(shù)據(jù)。

 

結論

本研究結果表明，與TraceFinder軟件配用的Thermo ScientificExactive GC Orbitrap高分辨率質譜儀是一個高性能的分析系統(tǒng)，可在*遵循SANTE指導文件的前提下，針對果蔬中的常規(guī)農(nóng)藥分析，提供穩(wěn)定的、高靈敏度的分析定量性能。

—經(jīng)檢測，99.3%的農(nóng)藥/基質組合可在低于MRL下檢測到，線性良好且符合所要求的性能標準。重要的是，在全掃描采集模式下，使用化合物數(shù)據(jù)庫對目標數(shù)據(jù)進行處理增加了分析物的范圍。

 

—當在復雜樣品基質中篩選農(nóng)藥時，以60,000 FWHM的分辨率進行采集顯著降低了基質干擾并提高了結果的置信度。針對較寬濃度范圍內(nèi)的所有化合物均達到sub-ppm的一致質量度，確保了化合物在不同濃度水平下檢測的置信度。

 

—西紅柿基質以10μg/Kg的濃度重復進樣表明系統(tǒng)能在較長時間內(nèi)保持性能一致性，符合常規(guī)檢測實驗室的要求。

【儀器/耗材清單】

儀器

ExactiveTMGCOrbitrapTM質譜儀

Thermo ScientificTMTriPlusTMRSHTM自動進樣器

Thermo ScientificTMTRACETM1310氣相色譜儀