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中級(jí)會(huì)員·6年
HTRF Human Total c-RAF Detection Kit
| 參考價(jià): | 面議 |
具體成交價(jià)以合同協(xié)議為準(zhǔn)- 產(chǎn)品型號(hào)
- revvity 品牌
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訪問次數(shù)：101更新時(shí)間：2024-10-30 16:35:30
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產(chǎn)品簡(jiǎn)介
| 供貨周期 | 現(xiàn)貨 | 貨號(hào) | 64CRAFTPEH |
|---|
產(chǎn)品介紹
產(chǎn)品參數(shù)
| 產(chǎn)品貨號(hào) | 產(chǎn)品名稱 | 規(guī)格 |
| 64CRAFTPEH | HTRF CRAF TOTAL KIT | 10K PTS |
總 cRaf 細(xì)胞檢測(cè)試劑盒旨在使用簡(jiǎn)化的混合后直接讀取、無需洗滌的方案，對(duì)總 cRaf 進(jìn)行定量。cRaf 在細(xì)胞增殖和分化中起著關(guān)鍵作用。該試劑盒可用于從基礎(chǔ)研究到高通量藥物篩選。它的多功能性意味著它適用于許多應(yīng)用，從基礎(chǔ)研究到細(xì)胞模型中的藥理學(xué)問題分析，并在腫瘤學(xué)和傳染病研究中有應(yīng)用。
產(chǎn)品特點(diǎn)
工作原理：
總 cRaf 檢測(cè)原理：
總 cRaf 檢測(cè)用于量化細(xì)胞裂解物中 cRaf 的表達(dá)水平。與蛋白質(zhì)印跡法不同，該檢測(cè)基于微孔板，不需要凝膠、電泳或轉(zhuǎn)膜。總 cRaf 檢測(cè)使用兩種標(biāo)記抗體，一種與供體熒光團(tuán)偶聯(lián)，另一種與受體偶聯(lián)。這兩種抗體對(duì)蛋白質(zhì)上不同的表位具有高度特異性。在細(xì)胞提取物中存在 eNOS 的情況下，加入這些偶聯(lián)物會(huì)使供體熒光團(tuán)與受體緊密接近，從而產(chǎn)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）信號(hào)。其強(qiáng)度與樣品中存在的蛋白質(zhì)濃度直接成正比，并在無需洗滌的檢測(cè)形式下提供了一種評(píng)估蛋白質(zhì)表達(dá)的方法。
總 cRaf 雙板檢測(cè)方案：
雙板方案涉及在 96 孔板中培養(yǎng)細(xì)胞，然后進(jìn)行裂解。接著將裂解物轉(zhuǎn)移到 384 孔低體積檢測(cè)板中，之后加入 HTRF 總 cRaf 檢測(cè)試劑。該方案能夠監(jiān)測(cè)細(xì)胞的活力和融合度。
總 cRaf 單板檢測(cè)方案：
使用 HTRF 試劑檢測(cè)總 eNOS 可以在一個(gè)用于培養(yǎng)、刺激和裂解的單板上進(jìn)行。無需洗滌步驟。這個(gè)為高通量篩選設(shè)計(jì)的方案能夠?qū)崿F(xiàn)微型化，同時(shí)保持強(qiáng)大的 HTRF 質(zhì)量。
檢測(cè)驗(yàn)證：
在 TPA 刺激的 HeLa 細(xì)胞中檢測(cè)總 c-RAF 和磷酸化 c-RAF（S43）：
HeLa 細(xì)胞以 100 微升的體積接種在 96 孔板中（每孔 100,000 個(gè)細(xì)胞），使用培養(yǎng)基并在 37°C、5% 二氧化碳的條件下孵育過夜。第二天，移除培養(yǎng)基，加入 50 微升無血清培養(yǎng)基，在 37°C、5% 二氧化碳的條件下使細(xì)胞饑餓 5 小時(shí)。然后用 50 微升不斷增加濃度的 TPA 在 37°C、5% 二氧化碳的條件下處理細(xì)胞 15 分鐘。
移除培養(yǎng)基后，用 50 微升補(bǔ)充裂解緩沖液 #2 在室溫下輕輕振蕩裂解細(xì)胞 30 分鐘，然后將 16 微升裂解物轉(zhuǎn)移到低體積白色微孔板中，再加入 4 微升預(yù)混的 HTRF 磷酸化 cRaf（Ser43）或總 cRaf 檢測(cè)試劑。孵育過夜后記錄 HTRF 信號(hào)。
在 TPA 刺激的 HEK293T 細(xì)胞中檢測(cè)總 c-RAF 和磷酸化 c-RAF（S43）：
HEK293T 細(xì)胞以 100 微升的體積接種在 96 孔板中（每孔 100,000 個(gè)細(xì)胞），使用培養(yǎng)基并在 37°C、5% 二氧化碳的條件下孵育過夜。第二天，移除培養(yǎng)基，加入 50 微升無血清培養(yǎng)基，在 37°C、5% 二氧化碳的條件下使細(xì)胞饑餓 5 小時(shí)。然后用 50 微升不斷增加濃度的 TPA 在 37°C、5% 二氧化碳的條件下處理細(xì)胞 15 分鐘。
移除培養(yǎng)基后，用 50 微升補(bǔ)充裂解緩沖液 #2 在室溫下輕輕振蕩裂解細(xì)胞 30 分鐘，然后將 16 微升裂解物轉(zhuǎn)移到低體積白色微孔板中，再加入 4 微升預(yù)混的 HTRF 磷酸化 cRaf（Ser43）或總 cRaf 檢測(cè)試劑。孵育過夜后記錄 HTRF 信號(hào)。
簡(jiǎn)化的通路：
RSK1 的功能和調(diào)節(jié)：
RAF 原癌基因絲 / 蛋白激酶（c-RAF）是 MAP 激酶通路的一部分，它將上游效應(yīng)物 Ras 與下游 MAPK/ERK 級(jí)聯(lián)連接起來。因此，它在包括增殖、分化、凋亡、存活和致癌轉(zhuǎn)化在內(nèi)的細(xì)胞命運(yùn)決定中發(fā)揮作用。
c-RAF 通過 PKC 的直接或間接作用在 Ser338 位點(diǎn)磷酸化而被激活，或者通過與 GTP 結(jié)合的 Ras 直接激活。通過 MAPK/ERK 依賴性反饋在 Ser43 位點(diǎn)磷酸化確保其失活。
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