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Leica SP8 FALCON 使用技巧

閱讀:1414        發(fā)布時間:2019-11-7

近期,我們介紹了 Leica SP8 FALCON 的一些應(yīng)用案例,它能實(shí)時測量分子間的相互作用 (FLIM-FRET),實(shí)時測量鈣濃度變化,實(shí)時測量熒光分子的代謝 (如癌變引起的 NADH 的壽命變化) 或者所處微環(huán)境的變化 (如 pH),能對光譜相近的不同染料或自發(fā)熒光和染料進(jìn)行拆分,還能與共聚焦的多種采圖模式 (如智能化大圖拼接、光譜掃描、時間序列、三維層切) 和技術(shù) (如 DIVE 多光子成像、STED 納米分辨率成像) 相結(jié)合??傊?, FALCON 是熒光功能成像的極jia工具。

 

那么今天咱們就講講 FALCON 的使用技巧,幫助大家更好地理解這個新技術(shù)。

熒光壽命測量步驟

SP8 FALCON 的熒光壽命成像 (FLIM) 功能內(nèi)置在共聚焦操作軟件 LAS X 里,只需點(diǎn)擊 FLIM 即可激活 (見下圖)。

接下來,我們只需三步就可以完成熒光壽命測量。本文中所用樣品為雛菊 (Bellis Perennis) 花蕾。

1. 預(yù)覽及調(diào)節(jié)參數(shù)

 

點(diǎn)擊預(yù)覽,系統(tǒng)同時顯示熒光強(qiáng)度圖、平均熒光壽命圖和平均熒光壽命曲線,并以光子數(shù)直方圖中的紅線來提示光子數(shù)的理想上限 (見下圖),便于我們調(diào)節(jié)激光強(qiáng)度獲得理想的光子數(shù) (以接近但不超過紅線為宜)。

2. 設(shè)置條件并采圖

 

在采集時間、采集幀數(shù)及大光子數(shù)三者中選擇設(shè)置一項(xiàng)即可 (見下圖),如果需要采集時間序列或者三維,按常規(guī)共聚焦采集模式設(shè)置總時長或?qū)忧衅瘘c(diǎn)/終點(diǎn)即可。然后點(diǎn)擊 start 進(jìn)行采圖。


3. 數(shù)據(jù)分析

 

選擇壽命成分?jǐn)?shù)量 (見下圖一棕色箭頭),點(diǎn)擊 Fit (圖一紅色箭頭),系統(tǒng)即自動進(jìn)行曲線擬合。壽命成分?jǐn)?shù)量可從 1 開始,直至獲得滿意的擬合曲線 (見圖三)。同時,系統(tǒng)根據(jù)擬合結(jié)果顯示熒光壽命圖 (見圖二)。

到這里,圖像和數(shù)據(jù)的采集及分析就完成了,點(diǎn)擊保存圖像和結(jié)果即可。

 

一鍵采圖,一鍵擬合,so easy!

 

壽命成分拆分圖像

當(dāng)然,我們還可以根據(jù)擬合出的壽命成分對圖像進(jìn)行拆分,以上述分析結(jié)果為例,點(diǎn)擊 FLIM Image Fit,系統(tǒng)自動按照擬合出的三種壽命進(jìn)行拆分,得到以下圖像。這特別適合于拆分光譜接近的不同染料或者染料和自發(fā)熒光。以后遇到多色熒光成像,再也不用擔(dān)心串色和分不開了。

對厚樣品,F(xiàn)ALCON 還可以直接采集和顯示三維的熒光壽命圖像 (見下圖),要做成視頻也*沒有問題,用 LAS X 的 3D 重建模塊就可以。

SP8 FALCON 的功能還遠(yuǎn)不止于此,它還能進(jìn)行任意感興趣區(qū)域分析、FRET 分析、Pattern Match 分析,和 DIVE、STED 結(jié)合成像,以及近期剛剛增加的 Phasor 功能,為傳統(tǒng)的熒光成像增加維度、拓寬思路。有興趣的話,且聽下回分解。

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