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原代細(xì)胞純化之酶消化法

閱讀:798          發(fā)布時(shí)間:2018-5-7

原代細(xì)胞酶消化法是比較常用的純化方法,不僅對(duì)貼壁細(xì)胞可行,能利用上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞對(duì)胰蛋白酶的耐受性不同,使兩者分開(kāi),達(dá)到純化的目的,對(duì)貼壁細(xì)胞與半貼壁及粘附細(xì)胞間的分離純化也是十分有效的。

(1)上皮細(xì)胞與成纖維細(xì)胞的分離純化
兩者在胰蛋白酶的作用下,由于成纖維細(xì)胞先脫壁,而上皮細(xì)胞要消化相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間才脫壁,特別是在原代細(xì)胞初次傳代和早期傳代中兩種差別尤為明顯,故可采用多次差別消化方法將上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞分開(kāi),方法如下:
①采用常規(guī)消化傳代方式 將0.25%胰蛋白酶注入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)兩次,每次加1mL(25mL培養(yǎng)瓶)來(lái)回輕搖1-2次,使胰蛋白酶流過(guò)所有細(xì)胞表面,然后倒掉。
②蓋好瓶塞(或蓋),將培養(yǎng)瓶放在倒置顯微鏡下觀察,發(fā)現(xiàn)纖維樣細(xì)胞變圓,部分脫落,立即加入2mL有血清的培養(yǎng)液終止消化。
③ 用彎頭吸管輕輕吹打纖維樣細(xì)胞生長(zhǎng)的區(qū)域(可事先在鏡下用記號(hào)筆在培養(yǎng)瓶上劃出記號(hào))。吹打時(shí)不要用力,也不要吹打上皮細(xì)胞生長(zhǎng)區(qū)域。吹打結(jié)束后,再用少 量培養(yǎng)液漂洗一遍,然后加入適量培養(yǎng)液于瓶?jī)?nèi)繼續(xù)培養(yǎng),也可重復(fù)上述操作再進(jìn)行一次,隔幾日后或下次傳代時(shí),再進(jìn)行上述操作,經(jīng)過(guò)幾次處理,就可將成纖維 細(xì)胞去除或?qū)烧叻珠_(kāi)。
(2)骨髓基質(zhì)肌樣細(xì)胞的純化
在血液細(xì)胞和骨髓細(xì)胞靜置培養(yǎng)時(shí),常有許多肌樣細(xì)胞和骨髓基質(zhì)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng),但也有 許多淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、粒細(xì)胞粘附其上,種類混雜,鑒于粘附細(xì)胞貼壁不牢固,也可用酶消化法使粘附細(xì)胞脫壁分離,以達(dá)到骨髓基質(zhì)細(xì)胞或血液中肌樣細(xì)胞與 淋巴細(xì)胞分開(kāi)和純化的目的。其方法如下:
①待基質(zhì)或肌樣細(xì)胞基本形成單層時(shí),倒去舊液,加入無(wú)鈣、鎂PBS漂洗,并用力搖動(dòng)后倒掉,反復(fù)洗2~3次后,一方面可洗去血清和鈣鎂離子以助酶消化,另一方面又可使大部分粘附細(xì)胞被洗掉,但仍留有不少粘附細(xì)胞。
②將0.25%胰蛋白酶注入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi),每瓶1mL(25mL培養(yǎng)瓶),輕輕搖動(dòng)讓胰蛋白酶流過(guò)細(xì)胞表面,作用1~2分鐘后再輕輕搖動(dòng)1~2次后倒去。
③蓋好瓶蓋,在普通顯微鏡下觀察,發(fā)現(xiàn)基質(zhì)或肌樣細(xì)胞由于貼壁較牢固未脫壁,而原先粘附的細(xì)胞已浮起,此時(shí)再加2mL PBS洗一次倒掉,盡量除去粘附細(xì)胞。
④加入含血清的培養(yǎng)基終止消化,再繼續(xù)用力搖動(dòng)后倒掉,加入培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。隔幾日或下次傳代前,再進(jìn)行上述操作,經(jīng)過(guò)幾次處理和傳代培養(yǎng)后就可將粘附原代細(xì)胞去除,將兩者分開(kāi),達(dá)到使骨髓基質(zhì)細(xì)胞或肌樣細(xì)胞純化的目的。

2592-95-2 1-羥基-苯并三氮唑(無(wú)水) (HOBt)( 2-8℃) 英文名稱: CAS號(hào): 1-Hydroxybenzotriazole

123333-53-9 1-羥基苯并三唑一水 英文名稱: CAS號(hào): 1-Hydroxybenzotriazole hydrate

5315-79-7 1-羥基芘 英文名稱: CAS號(hào): 1-HYDROXYPYRENE

23074-42-2 1-氰基金剛烷 英文名稱: CAS號(hào): 1-Adamantanecarbonitrile

143-08-8 1-壬醇;第九醇;辛基甲醇 英文名稱: CAS號(hào): 1-Nonanol;Octyl carbinol;Pelargonic alcohol;Nonalol;Alcohol C-9

18156-74-6 1-*基硅咪唑 英文名稱: CAS號(hào): N-(Trimethylsilyl)imidazole

112-55-0 1-十二硫醇 英文名稱: CAS號(hào): 1-Dodecanethiol
原代細(xì)胞

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