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酶聯(lián)免疫吸附的原理與方法
1. 1  原理
酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定的基本原理是把抗原或抗體在不損壞其免疫活性的條件下預(yù)先結(jié)合到某種固相載體表面; 測(cè)定時(shí), 將受檢樣品( 含待測(cè)抗體或抗原) 和酶標(biāo)抗原或抗體按一定程序與結(jié)合在固相載體上的抗原或抗體起反應(yīng)形成抗原或抗體復(fù)合物; 反應(yīng)終止時(shí), 固相載體上酶標(biāo)抗原或抗體被結(jié)合量( 免疫復(fù)合物) 即與標(biāo)本中待檢抗體或抗原的量成一定比例; 經(jīng)洗滌去除反應(yīng)液中其他物質(zhì), 加入酶反應(yīng)底物后, 底物即被固相載體上的酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物, zui后通過(guò)定性或定量分析有色產(chǎn)物量即可確定樣品中待測(cè)物質(zhì)含量[ 2] 。
1. 2  方法
ELISA 試劑盒常用的測(cè)定方法主要有直接法和間接法兩種: 直接法是酶標(biāo)記抗體與待檢測(cè)樣本中固相抗原直接作用, 加入底物后, 顯色( 其顏色深淺與樣本中抗原量成正比) ; 間接法是使已知抗原吸附在固相載體上, 與待檢測(cè)樣本中的抗體作用, 再加入酶標(biāo)記抗同種動(dòng)物抗體的免疫球蛋白( 抗抗體) , 使與特異抗原抗體復(fù)合物中的抗體作用, 加入酶底物, 顯色( 顏色深淺與樣本中抗體量成正比) [ 1] 。ELISA 有許多改良方法, 如雙抗體法( sandwichELISA) 、雙抗體夾心法( double_antibody sandwichtechnique) 、競(jìng)爭(zhēng)法、酶- 抗酶法和均質(zhì)法( homogeneousELISA) 、生物素- 親和素放大系統(tǒng)( biotina-vidin system, BAS) ELISA 及斑點(diǎn)_ELISA ( dot_ELISA)等, 大致可分為三類(lèi): ( a) 測(cè)定抗體的間接法; ( b)測(cè)定抗原的雙抗體夾心法: ( c) 測(cè)定抗原的競(jìng)爭(zhēng)法[ 3] 。前兩種方法主要用于測(cè)定抗體和大分子抗原, 適用于臨床診斷上, 而競(jìng)爭(zhēng)法是測(cè)定小分子抗原的方法, 因而尤其適用于食品分析。競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附分析法又可分為直接競(jìng)爭(zhēng)法和間接競(jìng)爭(zhēng)法。直接競(jìng)爭(zhēng)法主要有三步: 抗體吸附于固相載體, 溫育后清洗?? 加入含有抗原的待測(cè)液及酶標(biāo)記的抗原, 溫育后清洗?? 加入酶底物溫育后顯色, 判斷結(jié)果。間接競(jìng)爭(zhēng)法主要有四步: 抗原吸附于固體載體, 溫育后清洗??加入含有抗原的待測(cè)液和抗體, 溫育后清洗?? 加入酶標(biāo)記抗體, 溫育后清洗?? 加入酶底物溫育后顯色, 判斷結(jié)果[ 4] 。