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干細胞增殖功能的測定實驗
閱讀：746 發(fā)布時間：2018-6-21干細胞、B細胞表面具有識別抗原的受體和有絲分裂原受體，在特異性抗原刺激下可使相應淋巴細胞克隆發(fā)生增殖。植物血凝素（PHA）、刀豆蛋白A（ConA），抗CD2、抗CD3 McAb作為多克隆刺激劑可選擇性地刺激T細胞增殖；而抗IgM、含葡萄球菌A蛋白的菌體（SAC）、脂多糖（LPS，對小鼠有作用）則刺激B細胞發(fā)生增殖；美洲商陸（PWM）、腫瘤刺激劑PMA對T、B細胞的增殖均有刺激作用。zui近發(fā)現，integrin家族中VLA組中某些受體與相應配體結合后也能活化T細胞。目前臨床上zui常選用PHA刺激PBMC，根據形態(tài)學或氚標記胸腺嘧啶核苷（3H-TdR）摻入率測定T細胞的增殖水平。
實驗材料
PBMC
試劑、試劑盒
閃爍液RPMI1640CO2孵箱
儀器、耗材
細胞收集儀β液閃儀
實驗步驟
1. 無菌從肝素抗凝血中分離外周血單個核細胞（PBMC）洗滌后用10％FCS RPMI1640調整細胞數為1～2×106 /ml
2. 加入96 孔培養(yǎng)板中，1～2×105 細胞/100 μl/孔，每組設3孔。加入zui適劑量PHA，100 μl/孔，同時設不加PHA陰性對照。如觀察細胞因子（如IL-2）或其它刺激物（PMA）對增殖功能的調節(jié)作用，則根據加入因子的濃度而確定加入量，一般每孔zui終體積為200 μl，37 ℃、5 ％ CO2孵育，66 h
3. 每孔加入0.5～1 μci 3H-TdR（50μl），繼續(xù)培養(yǎng)6～12 h
4. 用DYQ-Ⅱ型多頭細胞收集儀收集樣品于"9999"型玻璃纖維濾紙上
5. 烤干后β液閃儀計數
6. 計算
（1）增殖水平直接用CPM值表示。
（2）也可用刺激指數（SI）表示
PHA（或實驗組）cpm-機器本底
SI＝───────────────
陰性對照組cpm-機器本底
收起
注意事項
1. 注意無菌操作。
2. PHA、ConA、PWM、LPS等在正式實驗前均需摸索zui適劑量或亞適劑量。和批號不同絲裂原作用常有很大差別，如Wellcome公司PHA終濃度zui適劑量為1～3 μg/ml，而廣州醫(yī)工所PHA約為20～100 μg/ml。
3. 根據實驗需要，對不同種（人、小鼠、大鼠、兔、狗等）不同來源淋巴細胞（胸腺、脾臟、淋巴結、扁桃腺、外周血等）均應進行zui適干細胞濃度、圈養(yǎng)時間和刺激物濃度的摸索。
phospho-ANTXR1(Tyr382) 巨噬細胞集落刺激因子受體抗體
phospho-APBB1 (Ser175) 巨噬細胞甘露糖受體抗體
phospho-APBB1 (Ser347) 精子形成相關凋亡蛋白7抗體
phospho-APG4B (Ser309) 精子相關抗原5抗體
phospho-APP/ABPP (Ser198) 精神障礙相關GAP蛋白抗體
phospho-APP/ABPP (Ser730) 精神分裂癥易感基因抗體
phospho-APP/ABPP (Thr743) 精氨酸加壓素受體2抗體
phospho-APP/ABPP (Thr756) 荊豆凝集素1抗體
phospho-APP/ABPP(Thr668) 緊密連接蛋白抗體
干細胞