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胰腺上皮細(xì)胞分離及培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)
閱讀：423 發(fā)布時(shí)間：2019-1-17| 提 供 商 | 上海雅吉生物科技有限公司 | 資料大小 | 250.8KB |
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實(shí)驗(yàn)方法原理
從豚鼠胰腺組織分離細(xì)胞，用紗布或尼龍網(wǎng)過濾細(xì)胞懸液，將過濾的細(xì)胞懸液輕輕加于 BSA 液上面。通過 3 次連續(xù)離心和混懸細(xì)胞，使呈團(tuán)狀的細(xì)胞分散。然后，將細(xì)胞接種于涂有膠原蛋白的培養(yǎng)器皿。
試劑、試劑盒 F12K 組織培養(yǎng)液含有 20% 小牛血清HBSSHBSS-DVC葡萄糖胰蛋白酶液胰蛋白酶液枸櫞酸緩沖液凡枸櫞酸三鈉鹽NaCl葡萄糖酚紅膠原蛋白酶液溶解膠原蛋白酶 硅化錐形瓶吸管
儀器、耗材 Blichner 漏斗透析管Sidearm 瓶聚丙烯離心管紗布 培養(yǎng)皿
實(shí)驗(yàn)步驟
材料
1. 無菌
（1）F12K 組織培養(yǎng)液：含有 20% 小牛血清（F12K-CS20)
?（2）HBSS
（3）HBSS-DVC: 不含 Ca2+ 和 Mg2+ 的 HBSS
（4）葡萄糖（Difco,0155-174,BDBiosciences)
（5）胰蛋白酶液：用枸櫞酸緩沖液配制 0.25% 胰蛋白酶液（1:250, Difco, BDBi-osciences)。 枸櫞酸緩沖液（pH7.6) 含有 3 g 凡枸櫞酸三鈉鹽、6 g/L NaCl 、5 g/L 葡萄糖和 0.02 g/L 酚紅。
（6）膠原蛋白酶液：1800U/ml，用 1XHBSS-DVC (pH 7.2) 溶解膠原蛋白酶 (GIBCO)。調(diào)整膠原蛋白酶液的 pH 至 7.2，在 4℃ 條件下用 12Kda 透析膜透析 4 h，透析液為含有 0.2% 葡萄糖的 HBSS-DVC。除去 HBSS 后，用 HBSS-DVC 重復(fù)此步驟 16～18 h 。過濾除菌，分裝成 10～20 ml，在 70℃ 以下的條件下儲(chǔ)存。
（7）25 ml 硅化錐形瓶（Bellco)
（8）吸管：5 或 10 ml, 大口徑（Bellco)
（9）Blichner 漏斗
（10）透析管（SpectroPor)
（11）Sidearm 瓶:250 ml
（12）聚丙烯離心管：50 ml
（13）紗布
（14）涂有膠原蛋白的培養(yǎng)皿（Biocoat，BD Biosciences)
2. 非滅菌
（1）水浴振蕩器（M5B 型，11-22-1，Backer)
（2）離心機(jī)
操作步驟
1. 配制膠蛋白原酶和胰蛋白酶（1:2) 混合消化液，加熱至 37°C 。
2. 在無菌條件下取出整個(gè)胰腺（0.5～1 g )，放人 F12K -CS20 中。
3. 剪除腸系膜和其他組織，將胰腺切成 1～3 mm 小塊。
4. 將組織塊移人盛有 5 ml 預(yù)熱的混合消化液的 25 ml 硅化錐形瓶，在 37℃ 條件下用水浴振蕩器振蕩消化（120r/min ,15 min )。加人新鮮消化液，重復(fù)此步驟 2～3 次，直至大部分組織被消化分散。
5. 每次振蕩消化后，使大的組織塊沉下，然后將上清液移入 50 ml 聚丙烯離心管。離心管盛有約 12 ml 冷 F12K-CS20 , 以中和消化液。
6. 離心（600r/min，5 min ) 后，用 5～10 ml 冷 F12K -CS20 混懸細(xì)胞，將離心管放在冰上。
7. 收集細(xì)胞懸液，經(jīng)數(shù)層滅菌紗布（放人 Blichner 漏斗內(nèi)）過濾。在過濾過程中，將漏斗柄插入真空瓶，輕輕吸細(xì)胞懸液。取少量細(xì)胞懸液，做定量分析。
8. 通常情況下，每毫克組織獲得 1X105～2X105 個(gè)細(xì)胞，90%～95% 細(xì)胞為活細(xì)胞。
9. 將 5X107～5X108 個(gè) 細(xì)胞加到 2～4 個(gè) 50 ml 聚丙烯離心管的液柱表面，每個(gè)離心管內(nèi)盛有 35 ml 添加 4% 冷 BSA 的 HBSS-DVC(pH 7.2)。然后，離心 (600r/min，5 min )。此步驟對(duì)于有效地將胰腺的腺泡細(xì)胞與胰島細(xì)胞、導(dǎo)管細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞分離是至關(guān)重要的。吸取上清液，重復(fù)此分離步驟 2 次，每次分離后收集細(xì)胞，用冷 F12K-CS20 混懸細(xì)胞。
10. 用 5～10 ml 冷 F12K-CS20 收集細(xì)胞。取少量細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)細(xì)胞。每毫克組織獲得 2X 104～5X104 個(gè)細(xì)胞，80%～95% 細(xì)胞為腺泡細(xì)胞。接種密度為 3X105 個(gè)細(xì)胞/cm2。在 72 h 內(nèi)，細(xì)胞貼壁，形成克隆。