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懸浮細(xì)胞的免疫熒光標(biāo)記實(shí)驗(yàn)
閱讀：483 發(fā)布時(shí)間：2019-1-3| 提 供 商 | 上海雅吉生物科技有限公司 | 資料大小 | 17.5KB |
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| 資料類(lèi)型 | PNG 圖片 | 瀏覽次數(shù) | 483次 |
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實(shí)驗(yàn)方法原理 免疫熒光標(biāo)記技術(shù)（immunofluorescence technique）是將已知的抗體或抗原分子標(biāo)記上熒光素，當(dāng)與其相對(duì)應(yīng)的抗原或抗體起反應(yīng)時(shí)，在形成的復(fù)合物上就帶有一定量的熒光素，在熒光顯微鏡下就可以看見(jiàn)發(fā)出熒光的抗原抗體結(jié)合部位，檢測(cè)出抗原或抗體。
實(shí)驗(yàn)材料 懸浮細(xì)胞
試劑、試劑盒 多聚-L-賴(lài)氨酸
儀器、耗材 離心機(jī)培養(yǎng)箱
實(shí)驗(yàn)步驟
1. 細(xì)胞在冰浴中冷卻，然后用臺(tái)式離心機(jī)于4℃以800 g 離心5 min，吸去培養(yǎng)液并以4℃PBS重懸細(xì)胞。
2. 離心吸去PBS，以1~2 ml 2%PFA固定液，或2%PFA固定液/0.1% Triton X-100重懸細(xì)胞，置冰上固定30 min。
3. 離心、吸去固定液，用15 ml 4℃ PBS重懸細(xì)胞，放5 min 后，用PBS再次洗滌細(xì)胞。
4. 稀釋的抗體于4℃用微量離心機(jī)以13 500 g 離心2 min，250 μl 抗體足夠用于5×106細(xì)胞。
5. 離心細(xì)胞，吸去PBS，重懸細(xì)胞于抗體中，置4℃溫育1 h。
6. 用4℃ PBS稀釋細(xì)胞和抗體至15 ml。
7. 離心，吸去PBS，以4℃ PBS重懸細(xì)胞，重復(fù)1次。
8. 第二抗體4℃用微量離心機(jī)以13 500 g 離心2 min，5×106細(xì)胞用250 μl 抗體足夠。
9. 吸去PBS，以第二抗體重懸細(xì)胞，4℃溫育1 h，重復(fù)步驟6及步驟7。
10. 除非立即觀察細(xì)胞，否則在進(jìn)行細(xì)胞濃縮的下一步操作之前應(yīng)以鋁萡包裹離心管并冷藏。
11. 離心細(xì)胞并以少量PBS重懸（勿用水），將細(xì)胞懸液滴于多聚-L-賴(lài)氨酸覆層的載玻片上，加上蓋玻片，盡可能馬上觀察結(jié)果。
收起
注意事項(xiàng)
1、熒光染色后一般在1h內(nèi)完成觀察，或于4℃保存4h，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，可能會(huì)使熒光提前衰退。
2、每次試驗(yàn)均需設(shè)置以下三種對(duì)照：
(1) 陽(yáng)性對(duì)照：陽(yáng)性血清+熒光標(biāo)記物;
(2) 陰性對(duì)照：陰性血清+熒光標(biāo)記物;
(3) 熒光標(biāo)記物對(duì)照：PBS+熒光標(biāo)記物。