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成纖維細(xì)胞的分離
閱讀：227 發(fā)布時(shí)間：2018-12-14| 提 供 商 | 上海雅吉生物科技有限公司 | 資料大小 | 250.8KB |
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下述的通用操作方案適用于小鼠、大鼠、倉(cāng)鼠和雞胚胎。選擇大約一半足孕時(shí)間的胚胎，10~13 天齡胚胎含有大數(shù)量的未分化的間質(zhì)細(xì)胞，成纖維細(xì)胞可從這些細(xì)胞衍生獲得。本實(shí)驗(yàn)來(lái)源于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)指南（上冊(cè))，作者：黃培堂。實(shí)驗(yàn)方法原理 下述的通用操作方案適用于小鼠、大鼠、倉(cāng)鼠和雞胚胎。選擇大約一半足孕時(shí)間的胚胎，10~13天齡胚胎含有大數(shù)量的未分化的間質(zhì)細(xì)胞，成纖維細(xì)胞可從這些細(xì)胞衍生獲得。圖4.1顯示了小鼠胚胎的取出和解剖，圖4.2顯示的是雞胚胎的取出過(guò)程。
實(shí)驗(yàn)步驟
1) 胚胎的分離。
適用哺乳動(dòng)物（倉(cāng)鼠、小鼠和大鼠）
a. 采用認(rèn)可的方案處死嚙齒動(dòng)物。
b. 立即在無(wú)菌超凈臺(tái)內(nèi)用 70% 乙醇擦洗整個(gè)動(dòng)物。若可能，置紫外燈下照射 5 分鐘。
c. 用無(wú)菌的鑷了和剪子在前腿下作一腹部水平切口，用無(wú)菌鑷子將皮膚扯向后腿。
d. 用另一無(wú)菌的剪刀和鑷子切開(kāi)腹部，取出含有胚胎的子宮，置于無(wú)菌的培蕎皿上。
e. 剔除胚胎周?chē)陌?，將胚胎放于無(wú)菌的含有無(wú)菌 PBS 的燒瓶中。
f. 漂洗胚胎，去掉 PBS。繼續(xù)用 PBS 漂洗胚胎直至清洗液清亮為止。
適用雞胚胎
a. 用 70% 乙醇擦洗雞蛋殼。
b. 用無(wú)菌剪刀輕敲雞蛋的圓端，輕輕去除蛋殼露出氣囊。
c. 用無(wú)菌攝子去除覆蓋于絨毛尿囊上的白膜。
d. 剪開(kāi)包膜，用彎鑷夾住胚胎頸部取出胚胎。
e. 棄頭部，將無(wú)頭的胚胎置于廣口燒杯中，用 PBS 漂洗。
2) 將 6~8 個(gè)胚胎轉(zhuǎn)移至一個(gè)小的無(wú)菌廣口燒杯屮，用新的無(wú)菌剪刀小心地絞碎胚胎,
用 PBS 漂洗。
3) 在無(wú)菌狀態(tài)下，將絞碎的胚胎轉(zhuǎn)移于一 500 ml 的無(wú)菌的有攪拌棒的燒杯中，加人
200~300 ml 用 HBSS 配制的 0.25％ 的無(wú)菌胰蛋白酶（CIBCO/BRL)。
4) 在溫暖的環(huán)境中或置于 37°C 培養(yǎng)箱中輕輕攪動(dòng) 15 分鐘。
5) 讓存留的組織塊在重力作用下慢慢沉降，將含冇懸浮細(xì)胞的液體轉(zhuǎn)移至一無(wú)菌大容積的離心管中，該管內(nèi)按照每 10 ml 上清加人 1 ml 牛血清的比例加人牛血淸以滅活胰蛋白酶。
6) 加人新鮮胰蛋白酶溶液（見(jiàn)前述步驟）于含有殘留未消化組織塊的 500 ml 燒杯中，重復(fù)步驟 4 和 5。
7) 離心混合的細(xì)胞懸液，1200r/min，5 分鐘，棄上清。
8) 用新鮮的無(wú)菌 PBS 重懸沉淀的細(xì)胞，按步驟 7 再次離心。
9) 用 PBS 反復(fù)洗滌細(xì)胞至上清清亮為止。
即用含有 10% 牛血清和抗生素（如青霉素、鏈霉素）的 DMEM(CIBCO/BRL)10 ml 再懸沉淀，并使終體積為 100 ml。
11) 讓殘留的大塊未破碎的組織或特殊顆粒物質(zhì)沉降。
可采用數(shù)層無(wú)菌紗布過(guò)濾細(xì)胞懸液以去除任何殘留的細(xì)胞塊。
12) 為確定現(xiàn)有細(xì)胞濃度，加人 0.2 ml 細(xì)胞懸液于 1.8 ml1% 醋酸溶液中以裂解紅細(xì)胞，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)（見(jiàn)第 2 節(jié)中的"細(xì)胞計(jì)數(shù)")
13) 按每 10 mm 平皿 1x107 至 4x107 細(xì)胞的數(shù)量接種于 10 ml 組織培養(yǎng)液中，在飽和濕度的 C02 培養(yǎng)箱中孵育直至細(xì)胞鋪滿。
14) 當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)滿后，去除培養(yǎng)液，用 10% 的溫暖的 Versene（用 PBS 配制的 0.53 mmol/L EDTA,GIBCO/BRL) 洗滌細(xì)胞層 2 次。
15) 棄 Versene，加人相同體積的溫暖化 0.05% 胰蛋白酶-EDTA(GIBCO/BRL)
16)37°C 孵育 5 分鐘
17) 用無(wú)菌吸管輕輕吹散細(xì)胞，并轉(zhuǎn)移至一含 1~2 ml 牛血清的無(wú)菌管中。
18) 離心，1200/min,5 分鐘，棄上清。
19) 再懸沉淀于 5 ml 培養(yǎng)液屮（見(jiàn)上文），另加人 15 ml 培養(yǎng)液，分裝于 2 個(gè) 100 mm 平皿中。
20) 置 37°C 飽和濕度的 C02 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞，直至細(xì)胞長(zhǎng)滿，繼續(xù)步驟 14~20 以傳代細(xì)胞。