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ELISA法檢測細(xì)胞凋亡
閱讀：190 發(fā)布時間：2018-8-20（一） 原理
細(xì)胞凋亡的發(fā)生，是由于鈣-鎂依賴性核酸酶進(jìn)入核小體間切割DNA,產(chǎn)生180bp～200bp或其倍數(shù)的核小體片段。而核小體由于與組蛋白H2A、H2B、H3和H4形成緊密復(fù)合物而不被核酸內(nèi)切酶切割。采用雙抗體夾心酶免疫法，應(yīng)用小鼠抗DNA和抗組蛋白的單克隆抗體，與核小體片段形成夾心結(jié)構(gòu)，可特異性檢測細(xì)胞溶解物中的核小體片段。
（二）材料與試劑
1．采用Boehringer Mannheim公司試劑盒，生物標(biāo)記的小鼠抗組蛋白單克隆抗
體。
2．過氧化物酶（-POD）標(biāo)記的小鼠抗DNA單克隆抗體
3．鏈霉親合素包被的微孔板
4．DNA－組蛋白復(fù)合物，作為陰性對照。
5．ABTS底物
6．溶解緩沖液
7．溫育緩沖液
8．底物緩沖液
（三）樣品
1．培養(yǎng)細(xì)胞或離體細(xì)胞的裂解物 細(xì)胞裂解步驟：收集細(xì)胞，離心后，用200µl溶細(xì)胞緩沖液重新懸浮，室溫下作用30min。
2．培養(yǎng)細(xì)胞的上清液
3．血漿（血清）
（四）操作方法
1．取樣品離心后（1 000r/min,10min）,吸取20µl上清液，加入鏈霉親合素包被的培養(yǎng)板孔中。
2．另加入80µl免疫反應(yīng)試劑 含抗－DNA－POD、抗組蛋白－生物素及溫育緩沖液（按1︰1︰18混合），室溫下孵育2h（置搖床上，250r/min）。
3．取上清，用300µl溫育緩沖液洗滌3次，小心移去洗滌液。
4．加入100µl底物緩沖液，室溫下孵育使顏色變化至適合（置搖床上）。
5．盡快作比色分析（10min～20min內(nèi)），用底物緩沖液作空白對照，以波長405nm，參考波長492nm進(jìn)行檢測。
（五）結(jié)果判定
按下列公式計算細(xì)胞釋放的單/低聚核小體片段的特別聚集值：
注：mU=吸收值（10-3）=雙孔吸收值的平均OD值－底物OD值，若樣品的吸收值超過比色測定范圍，應(yīng)適當(dāng)稀釋后再檢測。