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TNF的生物活性測定
閱讀：272 發(fā)布時間：2018-8-201． 材料和試劑
1.1培養(yǎng)液A ：DMEM培養(yǎng)液添加10%的胎牛血清（FBS）。
1.2培養(yǎng)液B：DMEM培養(yǎng)液添加10%的胎牛血清（FBS）和終濃度為0.7--1μg/ml
的放線菌素D。
1.3 L929細胞株：鼠結(jié)締組織纖維母細胞，來源于22天雄性C3H鼠皮下組織。
1.4 結(jié)晶紫染色溶液：0。05%結(jié)晶紫 (50mg結(jié)晶紫加入20ml乙醇,加蒸餾水定容至100ml)，蒸餾水稀釋。
1.5 脫色液：（1）乙二醇獨甲醚50%，蒸餾水稀釋。
（2）乙醇50%，乙酸0.01%(V/V)，蒸餾水稀釋。
1.6 胰酶：消化貼壁L929細胞。
1.7 半效稀釋度TNF標準品：1000IU/ml。
2. 實驗用具
超凈工作臺，細胞培養(yǎng)烘箱，酒精燈，顯微鏡，細胞計數(shù)器，微量移液器，細胞培養(yǎng)板，細胞稀釋槽，酶標儀。
3. 操作步驟
3．1樣板：棄L929細胞培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，加入800—900μl胰酶消化細胞，細胞收縮后，棄胰酶，加入4ml培養(yǎng)液A，吹打細胞，混勻，用細胞計數(shù)板在顯微鏡下計數(shù)，并計算所需細胞總數(shù)，培養(yǎng)液體積，將消化好未貼壁的細胞重新懸浮于*培養(yǎng)液A，并調(diào)整細胞濃度為10×104/ml左右并將細胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100μl,37°C，5%CO2
培養(yǎng)過夜或24小時，待細胞貼滿板壁80%以上時，方可加樣。
3．2 樣品處理和稀釋：將待測樣品和標準品用培養(yǎng)液B溶解至1 ml，（樣品為凍干粉狀）。如標準品為1000IU/ml，10倍稀釋至100IU/ml作為起始濃度，樣品則根據(jù)實際情況都做10倍梯度稀釋，并以低濃度定為起始濃度（以上操作均在24孔板中操作）。
從樣品和標準品中的起始濃度中取200μl加入到96孔板A2-A12中，其余各孔均加入150μl培養(yǎng)液B，再從A2-A12中各取50μl，對B-H各排進行逐級四倍梯度稀釋.
3．3 加樣：標準品和樣品經(jīng)稀釋后，吸去已經(jīng)培養(yǎng)好的細胞培養(yǎng)板中的上清液，每孔依次加樣100μl，并在邊緣未加樣的各孔加入100μl培養(yǎng)液B，消除邊緣效應，放入烘箱37°C，5%CO2，培養(yǎng)過夜。
3．4 染色和脫色：L929細胞培養(yǎng)過夜后，鏡檢在半數(shù)死亡孔到達D或E時終止反應，吸取上清，輕輕吹打2—3次，除死細胞，每孔加入染色液30μl，靜置5分鐘左右。
用流水輕輕沖掉染色液，每孔加入100μl脫色液脫色，輕輕搖動使脫色*，然后于酶標儀570nm波長下比色，測O.D.值,并設(shè)對照.
4. 處理數(shù)據(jù):在座標紙上以570nm O.D.值(雙孔加樣測兩點值的平均)對稀釋倍數(shù)做圖,并以標準品的低,高O.D.之平均值做一平行于X軸的直線交各曲線,以各相應曲線與該直線交點在X軸上讀出半效量的稀釋度,按下式計算效價:
TNF成品活性(IU/ml)=標準品效價*(樣品預稀釋倍數(shù)/標準品預稀釋倍數(shù))*(標準品半效量稀釋度/樣品相當于標準品半效量的稀釋度)