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單層貼壁細(xì)胞-細(xì)胞毒性試驗(yàn)-四唑鹽（MTT）比色法-實(shí)戰(zhàn)篇
閱讀：445 發(fā)布時(shí)間：2018-8-14| 提 供 商 | 上海雅吉生物科技有限公司 | 資料大小 | 531KB |
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單層貼壁細(xì)胞四唑鹽（MTT）比色法
僅供參考 MTT常用濃度為5mg/ml;
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《動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)--基本技術(shù)指南》
注：此書中MTT濃度為50mg/ml
1、藥物的細(xì)胞毒性
四唑鹽（MTT）比色法
操作步驟
接種細(xì)胞
（1）用胰蛋白酶消化匯合的單層細(xì)胞，將細(xì)胞收集到含血清的培養(yǎng)基中。
（2）離心細(xì)胞懸液,使細(xì)胞沉積下來(lái)。用培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)。
（3）將細(xì)胞稀釋至2.5×103-50×103 個(gè)/ml,每個(gè)微滴定板可容納20ml細(xì)胞重懸液。
（4）用加樣器在平底96孔板中間十列的各孔中加入200μl細(xì)胞懸液，每孔加0.5×103-10×103 個(gè)細(xì)胞。
（5）將200μl培養(yǎng)基加至第1列和第12列的8個(gè)孔中。第1列作讀板議的空白對(duì)照。
（6）將培養(yǎng)板放至塑料飯盒中，于37℃濕潤(rùn)環(huán)境中溫育1-3天，等細(xì)胞進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)可加入藥物。
添加藥物
（7）用培養(yǎng)基將細(xì)胞毒性藥物5倍系列稀釋，共制備8個(gè)濃度。
（8）對(duì)于貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞，去除第2-11列各孔的培養(yǎng)基。
（9）在第2列和第11列的8個(gè)孔中加入200μl新鮮配制的培養(yǎng)基，這些細(xì)胞作為對(duì)照。
（10）在第3-10列的細(xì)胞中加入細(xì)胞毒性藥物。每個(gè)藥物濃度僅需4個(gè)孔，這樣A-D行可用于種藥物，E-H行用于第二種藥物。
（11）向每組4 孔中各加入200μl藥物溶液。
（12）將培養(yǎng)板放回塑料盒中，溫育至確定時(shí)間。
生長(zhǎng)期
（13）在藥物作用期結(jié)束時(shí)，去除所有含有細(xì)胞的孔中的培養(yǎng)基，加入200μl新鮮的培養(yǎng)基。
（14）每日換液至2-3個(gè)PDTs[群體倍增時(shí)間]。
存活細(xì)胞數(shù)的估算
（15）在生長(zhǎng)期末，每孔中各加入200μl新鮮的培養(yǎng)基，在第1-11列所有孔中各加入50μl MTT。
（16）用鋁箔包裹培養(yǎng)板，于37℃濕潤(rùn)環(huán)境中溫育4 h。
（17）棄去孔中的培養(yǎng)基和MTT，在第1-11列所有孔中各加入200μl DMSO，以溶解殘留的MTT-甲臜結(jié)晶。
（18）在含有DMSO的各孔中加入甘氨酸緩沖液（每孔25μl）。
（19）立即在570nm處記錄吸光值。讀板儀用第1 列中含培養(yǎng)基和MTT但不含細(xì)胞的各孔調(diào)零。
分析
以藥物濃度為橫坐標(biāo)（X軸），吸光值為縱坐標(biāo)（Y軸）繪制曲線圖。第2列和第11列各孔中得出的平均吸光值作為對(duì)照吸光值，對(duì)照組吸光值減少一半時(shí)所需的藥物濃度為IC50 濃度。
四唑鹽（MTT）商品名為噻唑藍(lán)，
? 四唑鹽比色法的原理：活細(xì)胞中脫氫酶能將四唑鹽還原成不溶于水的藍(lán)紫色產(chǎn)物（formazan)，并沉淀在細(xì)胞中，而死細(xì)胞沒有這種功能。二甲亞砜（DMSO）能溶解沉積在細(xì)胞中藍(lán)紫色結(jié)晶物，溶液顏色深淺與所含的formazan量成正比。再用酶標(biāo)儀測(cè)定OD值。
無(wú)菌材料
? 生長(zhǎng)液；胰蛋白酶（0.25%+EDTA，1mmol/L,溶于PBSA中）；MTT： 3- (4,5) -雙甲基 - 2 -噻唑 - (2 ,5) -二甲苯基溴化四氮唑，50mg/ml,濾過除菌; Sorensen 甘氨酸緩沖液（0.1mol/L甘氨酸, 0.1mol/L NaCl,用1mol/L NaOH將PH調(diào)至10.5 ）;微滴定板（Linbro,ICN）; 微吸頭，放在高壓滅菌的吸頭盒中。
非滅菌材料的準(zhǔn)備
? 塑料盒（無(wú)毒的聚苯乙烯，裝培養(yǎng)板用）；加樣器；DMSO；ELISA讀板儀。
體會(huì)(更新中)
1、盡管細(xì)胞計(jì)數(shù)很重要，考慮到使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板所測(cè)結(jié)果的不穩(wěn)定性，建議不要過分依賴它。將細(xì)胞懸液大體計(jì)數(shù)并稀釋后，用微量加樣器分裝入一96孔板的 幾個(gè)孔內(nèi)（舊板亦可），鏡下觀察細(xì)胞密度是否合適。
2、加樣時(shí)使用多道加樣器，盡可能減少加樣誤差。加樣時(shí)請(qǐng)注意槍頭有無(wú)氣泡產(chǎn)生，避免液體吸入加樣器，勤換槍頭，頻率自己掌握。