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小鼠胚胎成纖維細胞的富集

1、給13-14天的孕鼠注射大約0.5ml阿佛丁。當(dāng)鼠麻醉后，實施斷頸法處死小鼠。

2、用70％乙醇擦拭腹部，把皮膚向后拉，暴露出腹膜。用消毒過的工具，剪開腹壁以暴露出子宮角。將子宮角移到10cm的皿里。用10ml不含鈣鎂離子的PBS洗三遍。

3、用剪刀剪開每一測的胚囊,并將胚胎移到培養(yǎng)皿中。

4、用兩副鐘表鑷子將胎盤和膜與胚胎分離開，分離后切除內(nèi)臟（所有深色的東西）。將胚胎轉(zhuǎn)移到(有蓋)培養(yǎng)皿中，用10ml不含鈣鎂離子的PBS洗三遍。

5、用帶有彎鉤的眼科剪將組織剪碎，當(dāng)你剪的很累以致于不能再剪的時候，加入2ml胰蛋白酶/EDTA繼續(xù)剪。再加入另外5ml胰蛋白酶/EDTA，并在37℃孵育大約20分鐘。此時，返回至步，對下一只鼠進行操作。

6、執(zhí)行1－4步，到將胚胎置于胰蛋白酶/EDTA中這一步。

7、吹打胰蛋白酶/EDTA中的胚胎，直到有很少的組織物殘留。將皿放回培養(yǎng)箱再孵育10分鐘。

8、用20ml培養(yǎng)基以終止胰蛋白酶/EDTA的消化，將皿中的物質(zhì)轉(zhuǎn)移至50ml錐形管中。

9、混勻管內(nèi)的物質(zhì)，加入到含有20ml培養(yǎng)基的T75培養(yǎng)瓶中。每個培養(yǎng)瓶中裝大約3個胚胎。

10、將這些培養(yǎng)瓶放在培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)過夜。

11、將胚胎置于PBS中，并重復(fù)第5步。

12、第二天更換培養(yǎng)基，以去除碎片和中毒的細胞及其分泌的物質(zhì)。

13、當(dāng)培養(yǎng)瓶中的細胞長到80-90%匯合時并仍處于指數(shù)生長期時，是凍存細胞的時期。一般說來，這發(fā)生在準(zhǔn)備胚胎的第二天。這可能或早或晚發(fā)生，所以請注意觀察你的培養(yǎng)瓶。

注釋：

我們已用CF－1品系的鼠制備了成纖維細胞。

培養(yǎng)基成分：

88％ DMEM

10％ FBS

1％  NEAA

1%   雙抗

對于新建立的細胞系，要對樣本進行支原體檢測。

小鼠胚胎成纖維細胞的消化/傳代

1、移去MEF培養(yǎng)基

2、用5ml不含鈣鎂離子的PBS洗滌細胞（以去除胰蛋白酶的抑制物）。

3、每個培養(yǎng)瓶里加入1.5ml的胰蛋白酶/EDTA（0.05%的胰蛋白酶），消化5min。

4、為了使細胞分散開，輕輕吹打細胞。

5、每加入1ml的胰蛋白酶/EDTA，加入至少1ml的MEF培養(yǎng)基以終止胰蛋白酶的消化。

6、將細胞懸液加入到15ml的錐形管中，吹打幾次，使細胞分散為單個的。

7、在新的T75培養(yǎng)瓶中加入10mlMEF培養(yǎng)基。

8、將細胞懸液分裝到新的T75培養(yǎng)瓶中，放在37℃培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。

注釋：

MEF培養(yǎng)基成分：

89% DMEM (Gibco # 12100-046)

10% FBS (Gibco # 16000-044)

1%  NEAA (Gibco # 11140-050)

MEF每傳一代就會生長得更慢些。你次傳代的比例可以是1:5，但是后一次的傳代（第4代或第5代）比例應(yīng)該是1:2。

小鼠胚胎成纖維細胞的凍存

重懸培養(yǎng)基：

80% DMEM

20% FBS

1%  NEAA

凍存培養(yǎng)基：

60％ DMEM

30％ FBS

20％ DMSO

1、用不含鈣鎂離子的PBS洗一次細胞。

2、加入胰蛋白酶/EDTA37℃消化大約5min。

3、將細胞吹打下來。

4、加入與胰蛋白酶/EDTA等體積的培養(yǎng)基以終止胰蛋白酶的消化。

5、吹散大塊組織。如果還有大塊組織存在，可將懸液加入到50ml的管中使其沉淀。

6、取上清液，將其分裝到錐形管中，1000rpm離心5min。

7、每個凍存瓶中加入0.5ml（凍存液的一半體積）的重懸培養(yǎng)基重懸細胞。

8、逐滴加入等體積的（0.5ml/瓶）凍存培養(yǎng)基，混勻?，F(xiàn)在DMSO的濃度是10％。

9、每個凍存瓶中加入1ml的細胞。

10、迅速將細胞轉(zhuǎn)移到凍存的容器中，-70℃凍存過夜。（細胞不能長時間放置在室溫而含有DMSO的情況下）

11、第二天將細胞放于液氮中長期保存。

注釋：

提前標(biāo)注好凍存細胞的以下信息：

細胞系名稱

傳代的代數(shù)

凍存細胞的數(shù)目

日期

Initials

注明凍存/解凍形式

小鼠胚胎成纖維細胞的解凍/復(fù)蘇

1、將凍存瓶從液氮中取出。

2、放在37℃水浴中快速解凍，being careful not to immerse the vial above the level of the cap.

3、當(dāng)僅還有一點冰晶殘留時，用95％的乙醇消毒凍存瓶的外面，并將其置于hood中。（為什么用95％的乙醇消毒？hood是什么？）

4、輕輕地上下翻轉(zhuǎn)細胞一次，將它們放入15ml錐形管中。

5、想管中逐滴加入10ml培養(yǎng)基。這一步操作不能少于兩分鐘。做快了對細胞將是一種打擊，你將得到比其他方法具有更低生活能力的細胞。

6、1000rpm離心5min。

7、將細胞重懸于10ml培養(yǎng)基中，然后放入T75培養(yǎng)瓶中。

8、放入37℃培養(yǎng)箱。

9、注明凍存/解凍的形式，以更新數(shù)據(jù)。

網(wǎng)友觀點是：

1、關(guān)于如何確底胚胎期12.5d~13d的小鼠？希望大家能夠介紹一下自己所采用的方法，集思廣益。我所采用的方法是選擇同一天出生的三對小鼠，到成熟（8~10 w）后，分三周合籠，（每周合籠一對），然后待早合籠的小鼠產(chǎn)崽后，再取另兩個雌鼠的胚胎。不知道這樣行不行，也沒注意別人是怎樣做的。另外問了幾個外科的同學(xué)也沒找到可以查出小鼠孕期的儀器。

2、關(guān)于提取MEF的比較好的protocol

3、關(guān)于MEF轉(zhuǎn)染時起耐受性如何？這個我以后主要做這些，可能會積累一定的經(jīng)驗，但現(xiàn)在肯定有各位朋友已經(jīng)從事或正在從事著方面的工作，希望能夠分享經(jīng)驗。

4、關(guān)于其分泌細胞因子能力？我從一些文獻上發(fā)現(xiàn)，MEF除了作為胚胎干細胞的飼養(yǎng)層以外，也是研究天然免疫的重要材料，如日本東京大學(xué)的 AKIRA的實驗室，大板大學(xué)的takashi fujita實驗室就發(fā)了相當(dāng)多的文章。從這些文獻可以看出，MEF分泌細胞因子能力遠遠強于HEK293等工程細胞，相當(dāng)于肝實質(zhì)細胞，略低于幾種免疫細胞。但較免疫細胞，我認為有其不可替代的優(yōu)勢：

（1）其并不是主要發(fā)揮免疫功能的細胞，只有在受到外界刺激時才會應(yīng)答，分泌細胞因子，免疫細胞在不受刺激時也會為了維持穩(wěn)態(tài)而不斷產(chǎn)生細胞因子，即使有嚴格的control 組，但專門的免疫細胞即使是同一種細胞（DC，NK，T）但不同的細胞分泌細胞因子的能力也是參差不齊的。會造成control 相對不一致。

（2）另一方面，由于這些免疫細胞大部分都是懸浮的，不太容易轉(zhuǎn)染，結(jié)果陽性率也會較低。

（3）現(xiàn)在的分離MEF的方法很便宜，不復(fù)雜，而分離純的免疫細胞（如NK，DC），需要MACS，F(xiàn)ACS等，這對目前國內(nèi)的實驗室經(jīng)費相對緊張的情況來說，不是很劃算。因此除非是需要研究某一種免疫細胞，如果是為了研究天然免疫或者adaptive immune過程中某中基因，或者蛋白，或者某一信號通路等的作用，MEF 細胞不失為一種選擇。

網(wǎng)友觀點：

1、我每次取的是16~18天的胚鼠 個人覺得無礙 我倒更喜歡大一點的胚胎 更好操作一點

2、我取的是皮膚 然后胰酶4度消化過夜 第二天終止消化 撕掉表皮 留下 減碎 用的100目濾網(wǎng)過濾 這個胰酶消化的時間是個關(guān)鍵 時間長了 細胞容易死 時間少了，表皮不容易揭下來 我有此就是這樣 消化了15個小時 結(jié)果接種下來的細胞不能貼壁 全死了

3、我用的培養(yǎng)液是DMEM+10%小牛血清 培養(yǎng)液也是關(guān)鍵 因為雖然都是成纖維細胞比較潑辣 但總歸是原代 可能還是比較嬌嫩 我前幾天就是這樣 后來發(fā)現(xiàn)是培養(yǎng)液出的問題 測的PH值都8.3了 細胞不死才怪 畢竟細胞耐酸不耐堿

4、原代培養(yǎng)的大天敵還是污染

網(wǎng)友觀點：

MEF對培養(yǎng)基和血清的要求不高，一般的都行我用過高糖DMEM和D/F-12，生長情況都行，而且看不出什么差別。血清也是以前用幾百塊錢的國產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清也長得也不錯，因為要養(yǎng)干細胞，所以現(xiàn)在換成進口Gibco胎牛的血清（兩千多/500ml），感覺細胞的狀態(tài)確實好了一些。我的血清濃度一般是16.66666%。

網(wǎng)友觀點：

細胞沒別的，就是很容易老化，一般我都是1:5~1:3傳代，3代之后細胞就出現(xiàn)衰老了，我感覺年輕增殖能力強的MEF應(yīng)該有著清晰的細胞輪廓，細胞立體效果不錯，在相差顯微鏡下，細胞核清晰，細胞纖長，正在分裂或是剛剛分裂的細胞沒有伸出偽足，但是同樣有著更加明亮的輪廓，與細胞邊緣相比，細胞呈深色（我覺得是透光效果不好）。一般在4×下觀察能看出細胞的狀態(tài)，此時能看到細胞呈梭形或是三角形。細胞鋪展很厲害，細胞的透光效果增加，說明開始衰老。衰老的MEF不要做feeder,但是也不是*不好。但是要是做轉(zhuǎn)染或是感染的話，出現(xiàn)衰老的MEF就不行了。所以一般就是3代以內(nèi)做。

我們用的就是WiCell的protocal養(yǎng)，和前面那位戰(zhàn)友發(fā)的差不多。只是我們用1mg/ml Collengase IV消化40min，用什么酶不重要，我覺得重要的就是種盤后的換液。原代2小時不管還有多少米貼都不要，傳代復(fù)蘇后一小時就換。消化的時候也是要舍得，0.05%Trypsin-EDTA(GIBCO)，5min消化不下來的也統(tǒng)統(tǒng)不要。因為健康的MEF就是易消化易貼壁。老化以及混雜的其他細胞（神經(jīng)、上皮）就沒那么快了。

附帶一句，易消化易貼壁是fibroblast的共性。