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感受態(tài)細(xì)胞制備/轉(zhuǎn)化
閱讀：226 發(fā)布時(shí)間：2018-7-24| 提 供 商 | 上海雅吉生物科技有限公司 | 資料大小 | 82.1KB |
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| 資料類型 | PNG 圖片 | 瀏覽次數(shù) | 226次 |
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摘要： 人工構(gòu)建的質(zhì)粒缺乏轉(zhuǎn)移必需的基因,不能自行完成從一個(gè)細(xì)胞到另一個(gè)細(xì)胞的接合轉(zhuǎn)移.這時(shí)就需要誘導(dǎo)受體細(xì)菌產(chǎn)生一種短暫的感受態(tài)以攝取外DNA.
質(zhì)粒制備的必要,人工構(gòu)建的質(zhì)粒載體中,一般缺乏此種轉(zhuǎn)移所必需的mob基因,因此不能自行完成從一個(gè)細(xì)胞到另一個(gè)細(xì)胞的接合轉(zhuǎn)移.如需將質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)移進(jìn)受體 細(xì)菌 ,需誘導(dǎo)受體細(xì)菌產(chǎn)生一種短暫的感受態(tài)以攝取外源 DNA .
轉(zhuǎn)化(Transformation)是將外源DNA分子引入受體細(xì)胞,使之獲得新的遺傳性狀的一種手段,它是 微生物 遺傳、分子遺傳、基因工程等研究領(lǐng)域的基本實(shí)驗(yàn)基因細(xì)胞.
轉(zhuǎn)化過程所用的受體細(xì)胞一般是限制修飾系統(tǒng)缺陷的變異株,即不含限制性內(nèi)切酶和 甲基化 酶的 突變 體(Rˉ,Mˉ),它可以容忍外源DNA分子進(jìn)入體內(nèi)并穩(wěn)定地遺傳給后代.受體細(xì)胞經(jīng)過一些特殊方法(如電擊法,CaCl2 ,RbCl(KCl)等化學(xué)試劑法)的處理后, 細(xì)胞膜 的通透性發(fā)生了暫時(shí)性的改變,成為能允許外源DNA分子進(jìn)入的感受態(tài)細(xì)胞 (Compenent cells).進(jìn)入受體細(xì)胞的DNA分子通過復(fù)制,表達(dá)實(shí)現(xiàn)遺傳信息的轉(zhuǎn)移,使受體細(xì)胞出現(xiàn)新的遺傳性狀.將經(jīng)過轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞在篩選培養(yǎng)基中培養(yǎng),即可篩選出轉(zhuǎn)化子(Transformant,即帶有異源DNA分子的受體細(xì)胞).目前常用的感受態(tài)細(xì)胞制備方法有CaCl2和RbCl(KCl)法,RbCl(KCl)法制備的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率較高,但CaCl2 法簡(jiǎn)便易行,且其轉(zhuǎn)化效率*可以滿足一般實(shí)驗(yàn)的要求,制備出的感受態(tài)細(xì)胞暫時(shí)不用時(shí),可加入占總體積15％的無菌甘油于-70℃保存(半年),因此CaCl2法為使用更廣泛.
為了提高轉(zhuǎn)化效率, 實(shí)驗(yàn)中要考慮以下幾個(gè)重要因素：
1. 細(xì)胞生長(zhǎng) 狀態(tài)和密度: 不要用經(jīng)過多次轉(zhuǎn)接或儲(chǔ)于4℃的培養(yǎng)的細(xì)菌,從－70℃或-20℃甘油保存的菌種中直接轉(zhuǎn)接用于制備感受態(tài)細(xì)胞的菌液.細(xì)胞生長(zhǎng)密度以剛進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)為好,可通過監(jiān)測(cè)培養(yǎng)液的OD600 來控制.DH5α菌株的OD600 為0.5時(shí), 細(xì)胞密度在5×107 個(gè)/ml左右(不同的細(xì)菌情況有所不同),這時(shí)比較合適.密度過高或不足均會(huì)影響轉(zhuǎn)化效率.
2. 質(zhì)粒的質(zhì)量和濃度: 用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA應(yīng)主要是超螺旋態(tài)DNA(cccDNA).轉(zhuǎn)化效率與外源DNA的濃度在一定范圍內(nèi)成正比,但當(dāng)加入的外源DNA的量過多或體積過大時(shí),轉(zhuǎn)化效率就會(huì)降低.1ng的cccDNA即可使50μl 的感受態(tài)細(xì)胞達(dá)到飽和.一般情況下,DNA溶液的體積不應(yīng)超過感受態(tài)細(xì)胞體積的5％.
3. 試劑的質(zhì)量: 所用的試劑,如CaCl2 等均需是純度的(GR.或AR.),并用超純水配制,分裝保存于干燥的冷暗處.
4. 防止雜菌和雜DNA的污染：整個(gè)操作過程均應(yīng)在無菌條件下進(jìn)行, 所用器皿, 如離心管, tip頭等是新的,并經(jīng)高壓滅菌處理,所有的試劑都要滅菌,且注意防止被其它試劑、DNA酶或雜DNA所污染, 否則均會(huì)影響轉(zhuǎn)化效率或雜DNA的轉(zhuǎn)入, 為以后的篩選、鑒定帶來不必要的麻煩.
本實(shí)驗(yàn)以E.coli DH菌株為受體細(xì)胞,并用CaCl2處理,使其處于感受態(tài),然后與pBS質(zhì)粒共保溫,實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化.由于pBS質(zhì)粒帶有氨芐青霉素抗性基因(Ampr ),可通過Amp抗性來篩選轉(zhuǎn)化子.如受體細(xì)胞沒有轉(zhuǎn)入pBS,則在含Amp的培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng).能在Amp培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的受體細(xì)胞（轉(zhuǎn)化子）肯定已導(dǎo)入了pBS.轉(zhuǎn)化子擴(kuò)增后,可將轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒提取出,進(jìn)行電泳、酶切等進(jìn)一步鑒定.
本實(shí)驗(yàn)以E.coli DH菌株為受體細(xì)胞,并用CaCl2處理,使其處于感受態(tài),然后與pBS質(zhì)粒共保溫,實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化.由于pBS質(zhì)粒帶有氨芐青霉素抗性基因(Ampr ),可通過Amp抗性來篩選轉(zhuǎn)化子.如受體細(xì)胞沒有轉(zhuǎn)入pBS,則在含Amp的培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng).能在Amp培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的受體細(xì)胞（轉(zhuǎn)化子）肯定已導(dǎo)入了pBS.轉(zhuǎn)化子擴(kuò)增后,可將轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒提取出,進(jìn)行電泳、酶切等進(jìn)一步鑒定.