欧美……一区二区三区,欧美日韩亚洲另类视频,亚洲国产欧美日韩中字,日本一区二区三区dvd视频在线

 一、CCK8檢測細胞增殖/毒性的原理

Cell Counting Kit-8（簡稱CCK-8）試劑可用于簡便而準確的細胞增殖和毒性分析。其基本原理為：該試劑中含有WST-8【化學名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽】，它在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓*（1-Methoxy PMS）的作用下被細胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物（Formazan dye）。生成的甲瓚物的數(shù)量與活細胞的數(shù)量成正比。因此可利用這一特性直接進行細胞增殖和毒性分析。

用途：藥物篩選、細胞增殖測定、細胞毒性測定、腫瘤藥敏試驗

CCK8的優(yōu)點：
使用方便，省去了洗滌細胞，不需要放射性同位素和有機溶劑；
CCK-8法能快速檢測；
CCK-8法的檢測靈敏度很高，甚至可以測定較低細胞密度；
CCK-8法的重復性優(yōu)于MTT法；
CCK-8法對細胞毒性??；
CCK-8細胞活性檢測試劑中為1瓶溶液，毋需預制，即開即用。
 CCK8的缺點：
與MTT法相 比，CCK8和XTT的價格比較貴。
CCK8試劑的顏色為淡紅色，與含酚紅的培養(yǎng)基顏色接近，不注意的話容易產(chǎn)生漏加或多加。
 
與以往的增殖/毒性測定試劑相比較：

 

二、CCK8檢測細胞增殖/毒性的方法
實驗一：細胞增殖分析
1、制備細胞懸液：細胞計數(shù)
2、接種到96孔板中：根據(jù)合適的鋪板細胞數(shù)，每孔約100ul細胞懸液，同樣的樣本可做3個重復。
3、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)：細胞接種后貼壁大約需要培養(yǎng)2-4小時，如果不需要貼壁，這步可以省去。
4、加入10ul CCK8：由于每孔加入CCK8量比較少，有可能因試劑沾在孔壁上而帶來誤差，建議在加完試劑后輕輕敲擊培養(yǎng)板以幫助混勻?；蛘咧苯优渲煤?0%CCK8的培養(yǎng)基，以換液的形式加入。
5、培養(yǎng)1-4小時:細胞種類不同，形成的Formazan的量也不一樣。如果顯色不夠的話，可以繼續(xù)培養(yǎng)，以確認最佳條件。特別是血液細胞形成的Formazan很少，需要較長的顯色時間（5-6小時）。
6、測定450nm吸光度：建議采用雙波長進行測定，檢測波長450-490nm，參比波長600-650nm。

實驗二：細胞毒性分析
1、制備細胞懸液：細胞計數(shù)
2、接種到96孔板中：根據(jù)合適的鋪板細胞數(shù)，每孔約100ul細胞懸液，同樣的樣本可做3個重復。
3、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)：細胞接種后貼壁大約需要培養(yǎng)2-4小時，如果不需要貼壁，這步可以省去。
4、加入不同濃度的毒性物質(zhì)
5、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)：加入毒性物質(zhì)的培養(yǎng)時間，要看毒性物質(zhì)的性質(zhì)和細胞的敏感性，一般要根據(jù)細胞周期來決定，起碼要一代以上的時間。
6、加入10ul CCK8：由于每孔加入CCK8量比較少，有可能因試劑沾在孔壁上而帶來誤差，建議在加完試劑后輕輕敲擊培養(yǎng)板以幫助混勻。
7、培養(yǎng)1-4小時:細胞種類不同，形成的Formazan的量也不一樣。如果顯色不夠的話，可以繼續(xù)培養(yǎng)，以確認最佳條件。特別是血液細胞形成的Formazan很少，需要較長的顯色時間（5-6小時）。
8、測定450nm吸光度：建議采用雙波長進行測定，檢測波長450-490nm，參比波長600-650nm。

注：
若暫時不測定OD值，可以向每孔中加入10 μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下。24小時內(nèi)測定，吸光度不會發(fā)生變化。
如果待測物質(zhì)有氧化性或還原性的話，可在加CCK8之前更換新鮮培養(yǎng)基（除去培養(yǎng)基，并用培養(yǎng)基洗滌細胞兩次，然后加入新的培養(yǎng)基），去掉藥物影響。當然藥物影響比較小的情況下，可以不更換培養(yǎng)基，直接扣除培養(yǎng)基中加入藥物后的空白吸收即可。

三、CCK8檢測細胞增殖/毒性的注意事項
當使用標準96孔板時，貼壁細胞的最小接種量至少為1,000 個/孔 (100 μl 培養(yǎng)基)。檢測白細胞時的靈敏度相對較低，因此推薦接種量不低于2,500 個/孔 (100 μl 培養(yǎng)基)。
酚紅和血清對CCK8法的檢測不會造成干擾，可以通過扣除空白孔中本底的吸光度而消去。
CCK8可以檢測大腸桿菌，但不能檢測酵母細胞。在細胞增殖實驗每次測定的過程中需要避免細菌污染，以免影響結(jié)果。
CCK-8在0-5℃下能夠保存至少6個月，在-20℃下避光可以保存1年。
當在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)時，培養(yǎng)板最外一圈的孔最容易干燥揮發(fā)，由于體積不準確而增加誤差。一般情況下，最外一圈的孔只加培養(yǎng)基，不作為測定孔用。
在培養(yǎng)基中加入CCK8，培養(yǎng)一定的時間，測定450 nm的吸光度即為空白對照。在做加藥實驗時，還應考慮藥物的吸收，可在加入藥物的培養(yǎng)基中加入CCK8，培養(yǎng)一定的時間，測定450 nm的吸光度作為空白對照。
金屬對CCK-8顯色有影響：當終濃度為1 mM的氯化亞鉛、氯化鐵、硫酸銅會抑制5%、15%、90%的顯色反應，使靈敏度降級。如果終濃度是10 mM的話，將會100%抑制。
懸浮細胞由于染色比較困難，一般需要增加細胞數(shù)量和延長培養(yǎng)時間。

1.  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

---

 

   一站式細胞解決方案

    針對基礎及臨床研發(fā)中的原代細胞和iPS細胞的實驗，由于原代細胞的分離和培養(yǎng)難度大，iPS細胞制作和分化的實驗操作復雜，除長期進行原代和iPS培養(yǎng)工作的實驗室，想要獲得足夠量的狀態(tài)好的細胞比較困難。

    依靠多年在細胞培養(yǎng)方面的積累，為客戶提供完整的細胞CRO解決方案。根據(jù)客戶需求，直接在細胞水平進行藥物或者試劑的刺激，觀察細胞狀態(tài)的變化或者特定通路上mRNA或蛋白的變化，也可以先制作動物模型，對動物進行處理后，分離特定的原代細胞進行需要的檢測。

    同時，我們可以依照客戶提供的具體實驗方案進行操作，也可以根據(jù)客戶要求進行實驗設計，并根據(jù)客戶實驗的規(guī)模和難度提供詳細的報價和實驗周期規(guī)劃。

 

服務項目：

 

 

服務流程：

    1.聯(lián)系我們，溝通客戶實驗計劃及目標，評估實驗的的可行性。    

    2.依照客戶要求，設計相應的實驗；或客戶已有實驗方案發(fā)送給我們，我們研究方案的可操作性。    

    3.確定最終的實驗方案，報價和周期。    

    4.簽訂服務合同，支付預付款。    

    5.開始實驗服務，并定期向客戶反饋和交流。    

    6.實驗完成，提供完整實驗說明和部分實驗結(jié)果。    

    7.支付尾款，向客戶提供完整的全部實驗報告和原始數(shù)據(jù)。    

    8.項目完成。