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谷氨酰胺酶（GLS） 活性測(cè)定試劑盒
閱讀：333 發(fā)布時(shí)間：2021-1-12谷氨酰胺酶(glutaminase, GLS) 活性測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)
微量法 100 管/96 樣
正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定
測(cè)定意義：
GLS（EC 3.5.1.2）存在于高等動(dòng)物和某些細(xì)菌以及植物根中，催化谷氨酰胺水解成谷氨酸和
氨，在氮素代謝中具有重要調(diào)控作用，尤其是調(diào)節(jié)游離氨含量和尿素代謝。
測(cè)定原理：
GLS 催化谷氨酰胺水解成 L-谷氨酸和氨，利用奈氏試劑檢測(cè)氨增加的速率，即可計(jì)算其酶
活性。
需自備儀器和用品：
臺(tái)式離心機(jī)、可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96 孔板、可調(diào)式移液槍、研缽、冰
和雙蒸水。
試劑組成和配制：
試劑一×2 瓶，60 mL，4 ℃保存；
試劑二×1 瓶，40 mL，4 ℃保存；
試劑三×1 瓶，60 mL，常溫保存；
試劑四×1 瓶，5 mL，常溫保存；
試劑五×1 瓶，3 mL，常溫保存；
試劑六×1瓶，3 mL，常溫避光保存。
粗酶液提取：
1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備：
細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量
（104個(gè)）：試劑一體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 試
劑一），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）；
8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。
組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，
加入 1mL 試劑一），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。
2、血清（漿）樣品：直接檢測(cè)。
測(cè)定步驟：
1、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 420nm，蒸餾水調(diào)零。
2、樣品測(cè)定（在 EP 管中加入下列試劑）：
試劑名稱（uL）
測(cè)定管
對(duì)照管
樣本
25
蒸餾水
25
試劑一
100
100
試劑二
400
400
混勻，37℃水浴 1 小時(shí)
試劑三
525
525
混勻，8000 g，25℃離心 10 min；取上清液，在 EP 管或 96 孔板中加入下列試劑
上清液
130
130
試劑四
30
30試劑五
20
20
試劑六
20
20
混勻，420nm 處讀取測(cè)定管和對(duì)照管吸光值，計(jì)算 ΔA=A 測(cè)定管-A 對(duì)照管。對(duì)照管只要做
一管。
酶活性計(jì)算：
a.用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下
1、血清（漿）GLS 活性
單位定義：每 mL 血清（漿）每小時(shí)催化谷氨酰胺生成 1μmol 氨定義為一個(gè)酶活力單位。
GLS（μmol /h/mL）＝363.1×(ΔA-0.1301)÷T=363.1×(ΔA -0.1301)
2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞 GLS 活性
（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：
單位定義：每 mg 蛋白質(zhì)每小時(shí)催化谷氨酰胺生成 1μmol 氨定義為一個(gè)酶活力單位。
GLS（μmol /h /mg prot）＝363.1×(ΔA-0.1301)÷Cpr÷T=363.1×(ΔA -0.1301)÷Cpr。
（2）按樣本鮮重計(jì)算：
單位定義：每 g 組織每小時(shí)催化谷氨酰胺生成 1μmol 氨定義為一個(gè)酶活力單位。
GLS（μmol /h /g 鮮重）＝363.1×(ΔA-0.1301)÷(W÷V 樣總) ÷T=363.1×(ΔA -0.1301)÷W。
（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算
單位定義：每 1 萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每小時(shí)催化谷氨酰胺生成 1μmol 氨定義為一個(gè)酶活力單位。
GLS（μmol /h /104 cell）＝363.1×(ΔA-0.1301)÷(500÷V 樣總)÷T =0.7262×(ΔA -0.1301)
V 樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，1h；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：
樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500 萬(wàn)。
b.用 96 孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下
1、血清（漿）GLS 活性
單位定義：每 mL 血清（漿）每小時(shí)催化谷氨酰胺生成 1μmol 氨定義為一個(gè)酶活力單位。
GLS（μmol /h /mL）＝726.2×(ΔA-0.1301)÷T=726.2×(ΔA -0.1301)
2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞 GLS 活性
（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：
單位定義：每 mg 蛋白質(zhì)每小時(shí)催化谷氨酰胺生成 1μmol 氨定義為一個(gè)酶活力單位。
GLS（μmol /h /mg prot）＝726.2×(ΔA-0.1301)÷Cpr÷T=726.2×(ΔA -0.1301)÷Cpr。
（2）按樣本鮮重計(jì)算：
單位定義：每 g 組織每小時(shí)催化谷氨酰胺生成 1μmol 氨定義為一個(gè)酶活力單位。
GLS（μmol /h /g 鮮重）＝726.2×(ΔA-0.1301)÷(W÷V 樣總) ÷T=726.2×(ΔA -0.1301)÷W。
（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算
單位定義：每 1 萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每小時(shí)催化谷氨酰胺生成 1μmol 氨定義為一個(gè)酶活力單位。
GLS（μmol /h /104 cell）＝726.2×(ΔA-0.1301)÷(500÷V 樣總)÷T =1.4524×(ΔA -0.1301)
V 樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，1h；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：
樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500 萬(wàn)。