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NADPH-細胞色素 C 還原酶（NCR）活性測定試劑盒說明書 微量法 100 管/96 樣 注意：正式測定之前選擇 2-3 個預期差異大的樣本做預測定。 測定意義： 細胞色素 P450 酶是一組主要存在于肝臟的同工酶，在外源物質(zhì)代謝中具有重要作用，尤其 是藥物和毒物的代謝。NCR 作為 P450 酶系的重要一員，催化氧化型 P450 還原再生。 測定原理： NCR 催化 NADPH 還原氧化型細胞色素 C，還原型細胞色素 C 在 550nm 處有特征吸收峰； 通過測定 550nm 吸光度的增加速率，來計算 NCR 活性。 自備儀器和用品： 普通離心機，超速離心機、可調(diào)式移液槍、紫外分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96 孔 板和蒸餾水。 試劑組成和配置： 試劑一：粉劑×2 瓶，4℃保存。臨用前根據(jù)用量每瓶加 100mL 蒸餾水充分溶解。 試劑二：液體×1 瓶，4℃保存。 試劑三：粉劑×1 管，-20℃保存。臨用前配制，加 1.04 mL 蒸餾水充分溶解，4℃保存。 試劑四：粉劑×1 管，4℃保存。臨用前配制，加 1100 μL 蒸餾水充分溶解，4℃保存。 粗酶液提?。?1、除去細胞核和線粒體等：稱約 0.5g 組織，加入 4℃預冷的 1 mL 試劑一，冰上充分研磨， 10 000g 4℃離心 30min，取上清液，轉(zhuǎn)移到超速離心管中。 2、粗制微粒體：4℃，100 000g，離心 60min，棄上清液。 3、除血紅蛋白等雜質(zhì)：向步驟 2 的沉淀中加 1 mL 試劑一，蓋緊后充分震蕩溶解，100 000g 離心 30min，棄上清液。 4、終微粒體：向步驟 3 的沉淀中加試劑二 0.5 mL，蓋緊后充分震蕩溶解，4℃保存待測。 NADPH-細胞色素 C 還原酶測定操作： 1. 分光光度計/酶標儀預熱 30 min，調(diào)節(jié)波長到 550 nm，蒸餾水調(diào)零。 2. 試劑二在 37℃水浴中預熱 30min。 3. 空白管：取微量石英比色皿/96 孔板，依次加入 10μL 蒸餾水、180μL 試劑二、10μL 試劑 三和 10μL 試劑四，迅速混勻后于 550nm 處測定 2min 內(nèi)吸光值變化，第 10s 和第 130s 吸光 值?！鰽 空白管=A2-A1。 4. 測定管：取微量石英比色皿/96 孔板，依次加入 10μL 提取液、180μL 試劑二、10μL 試劑 三和 10μL 試劑四，迅速混勻后于 550nm 處測定 2min 內(nèi)吸光值變化，第 10s 和第 130s 吸光 值。△A 測定管=A4-A3。 注意：空白管只需做一次。 NCR 活性計算公式公式： a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下 （1）按蛋白濃度計算 活性單位定義：37℃中，每毫克蛋白每分鐘催化產(chǎn)生 1μmol 還原型細胞色素 C 為 1 個酶活 單位。 NCR ((nmol/min /mg prot)= (△ A 測定管-△ A 空白管)÷(ε×d)×V 反總÷（Cpr×V 樣）÷T = 550×(△ A 測定管-△ A 空白管)÷Cpr （2）按樣本質(zhì)量計算 活性單位定義：37℃中，每克組織每分鐘催化產(chǎn)生 1μmol 還原型細胞色素 C 為 1 個酶活單 位。 NCR ((nmol/min/g)= (△ A 測定管-△ A 空白管)÷(ε×d)×V 反總÷(V 樣÷V 樣總×W)÷T =275×(△ A 測定管-△ A 空白管)÷W ε：還原型細胞色素 C 摩爾消光系數(shù)，19100L/mol/cm=0.0191L/μmol/cm；d：比色皿光徑（cm）， 1cm；V 反總：反應體系總體積（L），210μL=2.1×10-4 L；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度（mg/mL）， 需要另外測定；V 樣：加入反應體系中上清液體積（mL），10μL=0.01mL；V 樣總：提取液 體積，0.5 mL；T：反應時間（min），2min 。 b.使用 96 孔板測定的計算公式如下 （1）按蛋白濃度計算 活性單位定義：37℃中，每毫克蛋白每分鐘催化產(chǎn)生 1μmol 還原型細胞色素 C 為 1 個酶活 單位。 NCR ((nmol/min/mg prot)= (△ A 測定管-△ A 空白管)÷(ε×d)×V 反總÷（Cpr×V 樣）÷T = 1100×(△ A 測定管-△ A 空白管)÷Cpr （2）按樣本質(zhì)量計算 活性單位定義：37℃中，每克組織每分鐘催化產(chǎn)生 1μmol 還原型細胞色素 c 為 1 個酶活單位。 NCR ((nmol/min/g) = (△ A 測定管-△ A 空白管)÷(ε×d)×V 反總÷(V 樣÷V 樣總×W)÷T = 550×(△ A 測定管-△ A 空白管)÷W ε：還原型細胞色素 C 摩爾消光系數(shù)，19100L/mol/cm=0.0191L/μmol/cm；d：96 孔板光徑（cm）， 0.5cm；V 反總：反應體系總體積（L），210μL=2.1×10-4 L；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度（mg/mL）， 需要另外測定；V 樣：加入反應體系中上清液體積（mL），10μL=0.01mL；V 樣總：提取液 體積，0.5mL；T：反應時間（min），2min 。 注意事項： 試劑三、試劑四臨用前配制，配好未使用完的 4℃可保存兩天。