化工儀器網(wǎng)
技術(shù)文章
雙縮脲法蛋白含量測試盒
閱讀：331 發(fā)布時(shí)間：2020-12-1雙縮脲法蛋白質(zhì)含量測定試劑盒說明書
微量法 100T/96S
注意：正式測定之前選擇 2-3 個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定，確保蛋白濃度在 1～
10mg/ml 范圍內(nèi)。
測定意義：
樣品可溶性蛋白質(zhì)含量常常用于酶活性計(jì)算。此外，可溶性蛋白質(zhì)含量也用于食品等質(zhì)量分
析。
測定原理：
強(qiáng)堿性溶液中，雙縮脲與 CuSO4 形成紫色絡(luò)合物；紫色絡(luò)合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成
正比，而與蛋白質(zhì)分子量及氨基酸成分無關(guān)，故可用來測定蛋白質(zhì)含量。該方法測定范圍為
1~10mg 蛋白質(zhì)，適用于蛋白質(zhì)濃度高的樣品，尤其是動(dòng)物材料。
自備儀器和用品：
離心機(jī)、可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96 孔板、移液器和蒸餾水。
試劑組成和配制：
試劑一：液體×1 瓶，4℃保存。
標(biāo)準(zhǔn)品：液體×1 瓶，5 mg/mL，4℃保存。
樣品中可溶性蛋白質(zhì)提?。?/span>
1. 液體樣品：澄清無色液體樣品可以直接測定。
2. 組織樣品：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g
組織，加入 1mL 提取液（自備，根據(jù)需要選用酶提取緩沖液或者蒸餾水或者生理鹽水））
冰浴勻漿，8000g，4℃離心 10min，取上清，即待測液。（動(dòng)物樣品常常需要稀釋）
3. 細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（104 個(gè)）：提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建
議 500 萬細(xì)胞加入 1mL 提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率 300w，超聲 3 秒，間隔 7
秒，總時(shí)間 3min）；然后 8000g，4℃，離心 10min，取上清置于冰上待測。
測定操作：
1. 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱 30 min，調(diào)節(jié)波長到 540 nm，蒸餾水調(diào)零。
2. 空白管：取 0.5mL EP 管，加入 40μL 蒸餾水，200μL 試劑一，混勻后室溫靜置 15 min，
取 200μL 于微量玻璃比色皿/96 孔板，540nm 比色，記為 A 空白管。
3. 標(biāo)準(zhǔn)管：取 0.5mL EP 管，加入 40μL 標(biāo)準(zhǔn)液，200μL 試劑一，混勻后室溫靜置 15 min，
取 200μL 于微量玻璃比色皿/96 孔板，540 nm 比色，記為 A 標(biāo)準(zhǔn)管。
4. 測定管：取 0.5mL EP 管，加入 40μL 待測液，200μL 試劑一，混勻后室溫靜置 15 min，
取 200μL 于微量玻璃比色皿/96 孔板，540nm 比色，記為 A 測定管。
注意：空白管和標(biāo)準(zhǔn)管只需測定一次。
樣品中蛋白質(zhì)濃度計(jì)算公式：
C 待測（mg/mL）= C 標(biāo)準(zhǔn)管×(A 測定管－A 空白管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管－A 空白管)
=5×(A 測定管－A 空白管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管－A 空白管)
注意事項(xiàng)：
1.樣品蛋白濃度須在 1～10mg/ml 范圍內(nèi)，低于 1mg/ml 不能用此法，高于 10mg/ml 須做相
應(yīng)稀釋。因此測定前用 1～2 個(gè)樣做預(yù)實(shí)驗(yàn)，確保蛋白濃度在 1～10mg/ml 范圍內(nèi)。
2.待測樣品蛋白提取可用生理鹽水、雙蒸水或不含蛋白的 PBS 提取。該法受硫酸銨、Tris 緩
沖液干擾，提取液中應(yīng)不含這些物質(zhì)；否則改用 BCA 蛋白質(zhì)含量測定試劑盒。