活性氧（ROS）化學(xué)熒光法試劑盒說(shuō)明書

一、測(cè)定原理：

本試劑盒采用的 DCFH-DA(2，7-Dichlorofuorescin Diacetate)探針，是迄今常用、靈敏的細(xì)胞內(nèi)活性氧檢測(cè)探針。DCFH-DA 本身沒(méi)有熒光，可以自由穿過(guò)細(xì)胞膜，當(dāng)其進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)后，會(huì)被細(xì)胞內(nèi)的相關(guān)酯酶水解為 DCFH（Dichlorofluorescin）。而 DCFH 不能通透細(xì)胞膜，從而使探針很容易被標(biāo)記到細(xì)胞內(nèi)。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)有活性氧存在時(shí)，DCFH 被氧化為強(qiáng)綠色熒光物質(zhì) DCF（Dichlorofluorescein），其熒光在激發(fā)波長(zhǎng) 502nm，發(fā)射波長(zhǎng) 530nm 附近有大波峰，其熒光強(qiáng)度與細(xì)胞內(nèi)活性氧水平成正比。

二、試劑組成及保存（100T-500T）：

1、0.1ml 10mM DCFH-DA in DMSO，-20℃保存。

2、1ml 活性氧供氫體，4-8℃保存。

三、組織樣本操作步驟：（可用激光共聚焦顯微鏡觀察，也可用于流式細(xì)胞儀、熒光酶標(biāo)儀、熒光分光度計(jì)測(cè)定）

1、單細(xì)胞懸液制備：

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方法 1、采用單細(xì)胞懸液制備儀制備單細(xì)胞懸液。方法 2、酶消化法：

方法 3、機(jī)械法（網(wǎng)搓法）： 2、加入熒光探針：

①、取不進(jìn)行任何處理的細(xì)胞用 0.01M PBS 重懸，設(shè)為陰性對(duì)照管。陽(yáng)性對(duì)照管：用稀釋好的 DCFH-DA 重懸細(xì)胞沉淀，同時(shí)加入活性氧供氫體誘導(dǎo)細(xì)胞，推薦該試劑的工作濃度為 20～100µM。

②、樣本管：用稀釋好的 DCFH-DA 重懸細(xì)胞沉淀，細(xì)胞密度一般要求 1×106-2×107/ml。

③、37℃孵育細(xì)胞 30min～幾小時(shí)。通常為 30～60min 即可。

④、收集孵育（探針標(biāo)記）后的單細(xì)胞懸液，1000g，離心 5～10 分鐘，去上清收集細(xì)胞沉淀，用 PBS 洗滌 1～2 次。離心收集細(xì)胞沉淀用于熒光檢測(cè)；

3、熒光檢測(cè)：

①、將上述收集好的細(xì)胞沉淀用 PBS 重懸，并用于檢測(cè)；

②、波長(zhǎng)設(shè)置：激發(fā)波長(zhǎng) 500(500±15nm)，發(fā)射波長(zhǎng) 525 (530±20 nm)。也可按照 FITC 熒光檢測(cè)條件檢測(cè)。

③、結(jié)果以熒光度值表示。

四、細(xì)胞樣本操作步驟：（可用激光共聚焦顯微鏡觀察，也可用于流式細(xì)胞儀、熒光酶標(biāo)儀、熒光分光度計(jì)測(cè)定）

1、直接將探針加入培養(yǎng)液中：

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①、直接將 DCFH-DA 探針加入無(wú)血清培養(yǎng)基中：一般按照 1： 1000 用無(wú)血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA(終濃度為 10µM)。去除培養(yǎng)液后，加入適當(dāng)體積稀釋好的 DCFH-DA。加入的體積以能充分蓋住細(xì)胞為宜，通常對(duì)于 6 孔板的一個(gè)孔加入稀釋好的 DCFH-DA 不少于 1ml。

②、取一份不加探針，只加入培養(yǎng)基的細(xì)胞設(shè)為陰性對(duì)照管。陽(yáng)性對(duì)照管：取一份已加入探針的細(xì)胞，同時(shí)加入活性氧供氫體誘導(dǎo)細(xì)胞，推薦該試劑的工作濃度為 20～100µM。

③、37℃孵育細(xì)胞 30min～幾小時(shí)，通常為 30～60min 即可，孵育時(shí)間長(zhǎng)短與細(xì)胞類型、刺激條件、DCFH-DA 濃度有關(guān)。一般陽(yáng)性對(duì)照在刺激細(xì)胞 30 分鐘左右，即可觀察到明顯的綠色熒光。

④、吸去培養(yǎng)液，利用無(wú)血清培養(yǎng)液或者 0.01MPBS 反復(fù)吹打，肉眼觀察瓶底由半透明(細(xì)胞單層連接成片)轉(zhuǎn)為透明，細(xì)胞層幾乎全部吹打到 PBS 中。

⑤、將細(xì)胞懸液全部收集到 1.5ml 離心管中。用無(wú)血清培養(yǎng)液或者 PBS 洗滌 2 次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的 DCFH-DA。1000rpm/min，5min，吸凈上清后加入 PBS 重新懸浮細(xì)胞進(jìn)行測(cè)定。

⑥、波長(zhǎng)設(shè)置：激發(fā)波長(zhǎng) 500(500±15nm)，發(fā)射波長(zhǎng) 525 (530±20 nm)。也可按照 FITC

熒光檢測(cè)條件檢測(cè)。

⑦、結(jié)果以熒光度值示。

2、先收集細(xì)胞，制備成細(xì)胞懸液后測(cè)定

①、細(xì)胞收集：

• 貼壁細(xì)胞，吸去培養(yǎng)液，利用無(wú)血清培養(yǎng)液或者 0.01MPBS 反復(fù)吹打，肉眼觀察孔板底

部(瓶底)由半透明(細(xì)胞單層連接成片)轉(zhuǎn)為透明，細(xì)胞層幾乎全部吹打到 PBS 中。

b、將細(xì)胞懸液全部收集到 1.5ml 離心管中。用無(wú)血清培養(yǎng)液或者 0.01MPBS 洗滌 2 次，

1000rpm/min，離心 5min，吸凈上清，留細(xì)胞沉淀用于測(cè)定。

c、懸浮細(xì)胞按照常規(guī)方法離心(2000rpm/min，離心 5min)，收集細(xì)胞沉淀，用無(wú)血清培養(yǎng)液或者0.01MPBS 洗滌 2 次，1000rpm/min，離心 5min，吸凈上清，留細(xì)胞沉淀用于測(cè)定。

②、細(xì)胞重懸：細(xì)胞密度一般要求 1×106-2×107/ml，一般有兩種方法：

a、先加入無(wú)血清培養(yǎng)液或者 PBS 重懸細(xì)胞，然后根據(jù)加入培養(yǎng)液或者 PBS 的體積，按照 10µM的初始濃度(做預(yù)實(shí)驗(yàn)確定自身樣本適合濃度)加入探針，

b、先按照 10µM 的濃度將探針用無(wú)血清培養(yǎng)液或者 PBS 先稀釋好，然后用稀釋好的探針重懸上述細(xì)胞沉淀，制備成細(xì)胞懸液，

③、取一份不加探針，只加入培養(yǎng)基或 PBS 的細(xì)胞設(shè)為陰性對(duì)照管。陽(yáng)性對(duì)照管：取一份已加入探針的細(xì)胞懸液，同時(shí)加入活性氧供氫體誘導(dǎo)細(xì)胞，推薦該試劑的工作濃度為 20～ 100µM。

④、37℃孵育細(xì)胞 30min～幾小時(shí)，通常為 30～60min 即可，孵育時(shí)間長(zhǎng)短與細(xì)胞類型、刺激條件、DCFH-DA 濃度有關(guān)；每隔 3-5 分鐘顛倒混勻一下，使探針與細(xì)胞充分接觸。

⑤、收集孵育（探針標(biāo)記）后的單細(xì)胞懸液，1000rpm/min，離心 5min，吸凈上清，用 PBS 洗滌

1～2 次，離心收集細(xì)胞沉淀物用于熒光檢測(cè)。

⑥、將上述收集好的細(xì)胞沉淀用 PBS 重懸，并用于檢測(cè)。

⑦、波長(zhǎng)設(shè)置：激發(fā)波長(zhǎng) 500(500±15nm)，發(fā)射波長(zhǎng) 525 (530±20 nm)。也可按照 FITC

熒光檢測(cè)條件檢測(cè)。

⑧、結(jié)果以熒光度值表 活性氧（ROS）化學(xué)熒光法試劑盒說(shuō)明書