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乙酸激酶（ACK）測試盒
閱讀：324 發(fā)布時間：2020-11-18測定意義：
ACK主要存在于微生物中，催化乙酸和ATP生成乙酰磷酸和ADP，是細(xì)菌碳代謝和能量代謝的關(guān)鍵酶，尤其是在古細(xì)菌甲烷合成代謝中起著中樞作用。
測定原理：
（1）ACK催化乙酸鈉和ATP生成乙酰磷酸和ADP，（2）丙酮酸激酶催化ADP和PEP生成ATP和丙酮酸，（3）乳酸脫氫酶催化丙酮酸和NADH生成乳酸和NAD+，（4）在340nm下測定NADH氧化生成NAD+速率，即可反映ACK活性。
規(guī)格：100管/96樣
乙酸激酶（acetate kinase，ACK）試劑盒說明書
微量法
正式測定前務(wù)必取2-3個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定
測定意義：
ACK主要存在于微生物中，催化乙酸和ATP生成乙酰磷酸和ADP，是細(xì)菌碳代謝和能量代謝的關(guān)鍵酶，尤其是在古細(xì)菌甲烷合成代謝中起著中樞作用。
測定原理：
（1）ACK催化乙酸鈉和ATP生成乙酰磷酸和ADP，（2）丙酮酸激酶催化ADP和PEP生成ATP和丙酮酸，（3）乳酸脫氫酶催化丙酮酸和NADH生成乳酸和NAD+，（4）在340nm下測定NADH氧化生成NAD+速率，即可反映ACK活性。
需自備的儀器和用品：
紫外分光光度計/酶標(biāo)儀、臺式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水
試劑組成和配制：
提取液：液體 100mL×1 瓶，4℃保存；
試劑一：液體 18mL×1 瓶，4℃保存；
試劑二：粉劑×1 瓶，-20℃保存；
試劑三：液體×1 支，4℃保存；
樣本的前處理：
1、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；15000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。
2、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。15000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。
測定步驟：
1、分光光度計或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至340nm，蒸餾水調(diào)零。
2、樣本測定
（1）工作液的配置，將試劑二和試劑三轉(zhuǎn)移至試劑一中，充分混合溶解，置于37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）水浴5min；現(xiàn)配現(xiàn)用；
（2）在微量石英比色皿或96孔板中加入20μL樣本和180μL工作液，混勻，立即記錄340nm處 20s時的吸光值A(chǔ)1和3min20s后的吸光值A(chǔ)2，計算ΔA=A1-A2。
ACK 活性計算：
a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下
（1）按樣本蛋白濃度計算：
單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1nmol的NADH定義為一個酶活力單位。
ACK（nmol/min/mg prot）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(V 樣×Cpr) ÷T
=536×ΔA÷Cpr
（2）按樣本鮮重計算：
單位的定義：每g組織每分鐘消耗1nmol的NADH定義為一個酶活力單位。
ACK（nmol/min/g 鮮重）= [ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(W× V 樣÷V 樣總) ÷T
=536×ΔA÷W
（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算：
單位的定義：每1萬個細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘消耗1nmol的NADH定義為一個酶活力單位。
ACK（nmol/min/104cell）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T
=1.072×ΔA
V 反總：反應(yīng)體系總體積，2×10-4 L；ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V 樣：加入樣本體積，0.02 mL；V 樣總：加入提取液體積，1mL；T：反應(yīng)時間，3 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500 萬。
b.用96孔板測定的計算公式如下
（1）按樣本蛋白濃度計算：
單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1nmol的NADH定義為一個酶活力單位。
ACK（nmol/min/mg prot）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(V 樣×Cpr) ÷T
=1072×ΔA÷Cpr
（2）按樣本鮮重計算：
單位的定義：每g組織每分鐘消耗1nmol的NADH定義為一個酶活力單位。
ACK（nmol/min/g 鮮重）= [ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(W ×V 樣÷V 樣總) ÷T
=1072×ΔA÷W
（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算：
單位的定義：每1萬個細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘消耗1nmol的NADH定義為一個酶活力單位。
ACK（nmol/min/104cell）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T
=2.144×ΔA
V 反總：反應(yīng)體系總體積，2×10-4 L；ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L/mol/cm；d：96 孔板光徑，0.5cm；V 樣：加入樣本體積，0.02 mL；V 樣總：加入提取液體積，1mL；T：反應(yīng)時間，3 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500 萬。