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熒光素酶的測(cè)定實(shí)驗(yàn)
閱讀：888 發(fā)布時(shí)間：2020-9-8| 實(shí)驗(yàn)方法原理 | 熒光素 4-單氧酶（ATP-水解）提取于螢火蟲，Photinus Pyralis。
熒光素＋ATP＋O2→氧和蟲熒光素＋PPi＋H2O＋光
光密度 I 是和 Michaelis-Menten 等式相關(guān)的
式中，H 是 Planck 常量；v 是發(fā)射光的頻率。當(dāng) ATP 濃度非常低（［ATP］＜＜Km）時(shí)，Michaelis-Menten 等式就可以簡(jiǎn)化成：
I＝常量 ×［ATP］
常量＝Ｖ/Km。光密度與 [ATP] 成正比。 |
|---|---|
| 實(shí)驗(yàn)材料 | 熒光素酶 |
| 試劑、試劑盒 | Tris-乙酸 ATP MgSO4 熒光素 |
| 儀器、耗材 | 分光光度計(jì) |
| 實(shí)驗(yàn)步驟 | 實(shí)驗(yàn)所需「試劑」具體見「其他」
開始加入 0.01 ml ATP
10 s 后（25℃）讀光密度值（562 nm 處的放射大值）。利用在 0.05～0.5 umol/L 之間的 ATP 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。
一個(gè)酶單位被定義為，在 25℃ 甘氨酸-Tris pH 7.6 溶液中，含 5 pmol ATP 及 7.5 nmol熒光素的 50 ul 實(shí)驗(yàn)混合物所測(cè)量到的光輸出。一個(gè)光輸出單位產(chǎn)生一個(gè)生物計(jì)高峰相當(dāng)于在 PPO/POPOP 雞尾酒中 14C 的 0.02 uCi（1991 年以前，1 個(gè)單位是指 pH 7.7、25℃ 時(shí)，存在 0.6 mmol/L ATP 和 0.1 mmol/L D-熒光素的條件下，每分鐘能產(chǎn)生 1 nmol 焦磷酸的熒光素的量）。 |
| 注意事項(xiàng) |
|
| 其他 | 試劑
0.1 mol/L Tris-乙酸，pH 7.75
10 mol/L ATP（二鈉鹽，三水合物，Mr＝605.2；準(zhǔn)備 10 mmol/L 60.5 mg 溶于 10 ml 溶液并且稀釋 10 ul 于 10 ml 水中）
0.1 mol/L MgSO4（MgSO4·7H2O，Mr＝246.5；246 mg 溶于 10 ml 水中）
1 mol/L 熒光素（4，5-二氫-［6-羥基-2-苯噻唑］-4-噻唑酸，Mr＝280.3；鈉鹽，Mr＝302.3；3 mg 溶于10 ml 0.1 mol/L Tris-乙酸 pH 7.75， 儲(chǔ)存于 -20℃）。
熒光素酶（提取于螢火蟲，1 ug/ml溶于 0.1 mol/L Tris-乙酸，pH 7.75） |
