化工儀器網
技術文章
雞胚成纖維細胞制備實驗
閱讀：950 發(fā)布時間：2018-12-29減毒的復制缺陷痘苗病毒 Ankara（MVA），作為標準痘苗病毒株的替代物，可以作為載體表達外源蛋白。MVA 是痘苗病毒 Ankara 在雞胚成纖維細胞中通過多次傳代（>570 次）得到的。盡管MVA可以表達重組蛋白，但其在人類和大部分哺乳動物細胞中不能包裝成具有感染能力的病毒顆粒，因此需制備專門用于培養(yǎng) MVA 的雞胚成纖維細胞。
本實驗主要介紹雞胚成纖維細胞的制備。
實驗方法原理
用雞胚制備培養(yǎng)雞胚成纖維細胞。
實驗材料 9 日齡雞胚
試劑、試劑盒 70% 乙醇胰酶／EDTA無添加 MEM 培養(yǎng)基* MEM-10 培養(yǎng)基
儀器、耗材 無菌解剖剪無菌鑷子100 cm2 無菌培養(yǎng)皿10 ml 注射器無菌胰酶消化瓶（帶磁力攪拌棒）CO2 培養(yǎng)箱500 ml 燒杯紗布 Sorvall 離心機250 ml 離心管150 cm2 組織培養(yǎng)瓶
實驗步驟
1. 將 10 只 9 日齡雞胚有空氣部分朝上放置，噴上 70% 乙醇。
2. 用無菌的解剖剪將雞蛋的頂部打開，剪掉膜上蛋殼，使膜保持完整。用無菌鑷子將膜取掉。其他雞蛋亦重復相同操作。
3. 取出雞胚，放入無菌的 100 cm2 培養(yǎng)皿。
4. 剪掉每個雞胚的頭和足，將剩余的身體放入無菌的 100 cm2 平皿中，加入 10 ml 無添加劑的 MEM 培養(yǎng)基。通過 10 ml 注射器（5 個雞胚/注射器）擠壓，將雞胚切碎并打人無菌的胰酶消化瓶中。
5. 加入 100 ml 37℃ 的胰酶/EDTA，并在加濕的 5% CO2 培養(yǎng)箱中 37℃ 持續(xù)攪拌溫育 5 min。
6. 將液體從無菌胰酶消化瓶中倒人杯口帶兩層紗布的 500 ml 燒杯，將過濾后的液體轉移至 250 ml 離心瓶中。
7. 向含有剩余組織的無菌胰酶消化瓶中加入 100 ml 新鮮的胰酶/EDTA，37℃ 溫育。
8. 將消化液倒入另一個杯口帶兩層紗布的 500 ml 燒杯，并將過濾后的液體加入先前的 250 ml 離心瓶中。
9. 在 Sorvall RC-3B 離心機中，4℃，1200 g 離心 10 min。
10. 丟棄上清，加入 10 ml MEM-10 *培養(yǎng)基，反復抽吸 10～15 次重懸沉淀，并將體積調整至 100 ml。
11. 將懸液轉移至 250 ml 離心瓶中，4℃，1200 g 離心 10 min。
12. 用 5 ml MEM-10 *培養(yǎng)基重懸沉淀，并將體積調整至 30 ml。
13. 將細胞懸液按每瓶 1 ml 加入到 30 個含有 30 ml MEM-10 *培養(yǎng)基的 150 cm2 組織培養(yǎng)瓶中。
14. 37℃ 培養(yǎng)幾天直至細胞長滿，然后將培養(yǎng)瓶轉移至加濕的 5% CO2 培養(yǎng)箱中 31℃ 保存。
CEF 細胞培養(yǎng)液能夠在 31℃ 保存 2～3 個星期。原代的 CEF 細胞也能直接用于病毒生長，或將胰酶處理后的 CEF 細胞凍存在液氮中留以后使用。