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實(shí)驗(yàn)材料    樣品
試劑、試劑盒    PBS兩性霉素慶大霉素
儀器、耗材    大剪刀刮刀燒瓶鋼篩網(wǎng)離心管層流柜
實(shí)驗(yàn)步驟    
1. 準(zhǔn)備下列器械并消毒（高壓滅菌，或者可能的話(huà)一次性使用）：

大剪刀（兩把）

刮刀（兩或三把）

胰蛋白酶消化的燒瓶（每 30 g 絞碎樣品一個(gè)）

帶接液器的 250-μM 鋼篩網(wǎng)

15-ml 和 50-ml 離心管

2. 分離組織樣品。所有操作在層流柜中進(jìn)行。

(1) 從腹整形樣品分離

① 解剖樣品，去除任何皮膚、筋膜、肌肉等，只保留脂肪組織。稱(chēng)重樣品，每 10 g 分裝一份。

② 在無(wú)菌盤(pán)上，用剪刀將樣品剪碎。

③ 用 60 ml 注射器（不帶針頭）吹吸樣品，反復(fù)3次或至樣品充分液化。

④ 取 20 ml 組織放入裝有 20 ml PBS 的 50 ml 離心管，混勻，700 r/min 離心 5 分鐘吸出含血水相，重復(fù)操作，直至樣品相對(duì)無(wú)血。

(2) 從吸脂樣品分離

① 置真空包裝樣品于篩網(wǎng)上，用含 0.5 μg/ml 兩性霉素和 200 IU/ml 慶大霉素，200 μg/ml 鏈霉素的 PBS 反復(fù)沖洗。沖洗過(guò)程中用刮刀在被沖洗物周?chē)鷶噭?dòng)，輔助沖洗。

② 取 20 ml 組織放入裝有 20 ml PBS 的 50 ml 離心管，混勻，700  r/min 離心 5 分鐘。吸掉含血水相。

3. PBS 溶解 BSA 至終濃度 4.0 mg/ml（PBS/BSA）；過(guò)濾除菌。配制膠原酶溶液，PBS/BSA 溶解膠原酶和 DNA 酶，終濃度分別為 4.0 mg/ml 和 0.02 mg/ml，0.2 μM 濾膜過(guò)濾除菌。

10 ml 溶液大約可以處理 10 ml 脂肪樣品。

4. 用無(wú)菌刮刀把步驟2中剪碎的脂肪組織刮到胰蛋白酶消化的燒瓶中，然后加入膠原酶，每毫升組織加 1 ml。

5. 37℃ 80 r/min 旋動(dòng)保溫 30 分鐘。

6. 消化的同時(shí)，用 PBS 稀釋 PBS/BSA（4.0 mg/ml BSA）至 BSA 終濃度 0.2 mg/ml。

7. 消化樣品倒入 50 ml 離心管（每管約 20 ml）。

8. 吊筒式醫(yī)用臺(tái)式離心機(jī)室溫 1500 r/min 離心 5 分鐘。

9. 液態(tài)脂和水相倒入另一 50 ml 離心管。由于細(xì)胞沉淀極易被倒掉，使用無(wú)菌離心管。

10. 細(xì)胞重懸于 5 ml PBS（0.2 mg/ml BSA），1500 r/min 離心 5 分鐘，倒掉上清。沉淀懸于 1 ml 含 5% FCS 的 PBS（PBS/FCS）中。