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小鼠角質(zhì)細(xì)胞的分離和培養(yǎng)
閱讀：348 發(fā)布時(shí)間：2018-12-10實(shí)驗(yàn)方法原理
將人滑膜從機(jī)體中取出，經(jīng)胰酶、螯合劑（常用EDTA）處理，分散成單細(xì)胞，置α-MEM生長(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使細(xì)胞得以生存、生長(zhǎng)和繁殖。
實(shí)驗(yàn)材料 滑膜組織
試劑、試劑盒 Ⅰ型膠原酶胎牛血清生理鹽水PBS
儀器、耗材 超凈臺(tái)解剖剪過(guò)濾網(wǎng)離心管記數(shù)板培養(yǎng)瓶
實(shí)驗(yàn)步驟
一、實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備
1. 滑膜組織：將外科手術(shù)切下的組織在手術(shù)臺(tái)上請(qǐng)護(hù)士將標(biāo)本放入低溫生理鹽水中，在手術(shù)完成時(shí)將標(biāo)本放入PBS冰水液中并放入消毒的容器中帶回實(shí)驗(yàn)室。
2. 試劑：4 mg/mlⅠ型膠原酶(α-MEM配制)，培養(yǎng)液(含10%胎牛血清的α-MEM)。
3. 器械：手術(shù)器械。
二、方法
1. 將切下的組織在手術(shù)臺(tái)上請(qǐng)護(hù)士將標(biāo)本放入低溫生理鹽水中(靜止)，在手術(shù)完成時(shí)將標(biāo)本放入PBS冰水液中并放入消毒的容器中帶回實(shí)驗(yàn)室。
2. 在超凈臺(tái)中將標(biāo)本放入培養(yǎng)皿中，加入α-MEM洗滌。
3. 獲得組織切開(kāi)，仔細(xì)辨認(rèn)于關(guān)節(jié)反折處及增生的白色光滑的滑膜組織，附于關(guān)節(jié)軟骨面的增生的血管翳也為滑膜組織(可作另一管消化)，仔細(xì)剔除脂肪組織，用α-MEM洗二次(以去除紅細(xì)胞)，放在小青瓶中用解剖剪銳性切碎。
4. 用雙倍獲得組織的體積含有4 mg/mlⅠ型膠原酶的α-MEM消化37℃孵育120分鐘(在此期間震動(dòng)混勻數(shù)次)。
5. 30分鐘后收集管細(xì)胞：細(xì)胞懸液經(jīng)70 μm細(xì)胞濾網(wǎng)過(guò)濾，用1500-2000轉(zhuǎn)離心6分鐘，上清為Ⅰ型膠原酶加入未過(guò)濾網(wǎng)的組織，繼續(xù)用于消化。
6. 離心管底細(xì)胞用α-MEM離心洗滌2次，每次用α-MEM重懸浮后用1500-2000轉(zhuǎn)，離心6分鐘，后一次用記數(shù)板觀察到有細(xì)胞。細(xì)胞終懸浮于含有10%胎牛血清的α-MEM中，接種到培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。
7. 60鐘后收集第二管細(xì)胞：細(xì)胞懸液經(jīng)70 μm細(xì)胞濾網(wǎng)過(guò)濾，用1500-2000 rpm離心6分鐘；用α-MEM洗2次，每次用α-MEM重懸浮后用1500-2000 rpm離心6分鐘，后一次用記數(shù)板觀察細(xì)胞并計(jì)數(shù)。細(xì)胞終懸浮于α-MEM含有10%胎牛血清中，接種到培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。
8. 必要時(shí)可做第三管細(xì)胞收集；并立即作原代滑膜細(xì)胞培養(yǎng)。
9. 每2-3天換液一次。
收起
注意事項(xiàng)
1. 全培用α-MEM或RPMI1640或DMEM，加10%胎牛血清。不能用小牛血清，胎牛血清用國(guó)產(chǎn)即可；
2. 必須用Ca2+-free的PBS。
其他
實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備
1. 滑膜組織：將外科手術(shù)切下的組織在手術(shù)臺(tái)上請(qǐng)護(hù)士將標(biāo)本放入低溫生理鹽水中，在手術(shù)完成時(shí)將標(biāo)本放入PBS冰水液中并放入消毒的容器中帶回實(shí)驗(yàn)室。
2. 試劑：4 mg/mlⅠ型膠原酶(α-MEM配制)，培養(yǎng)液(含10%胎牛血清的α-MEM)。
3. 器械：手術(shù)器械。