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近年來單克隆抗體已廣泛應用于基礎(chǔ)理論與臨床應用研究［1］。如何制備質(zhì)量好產(chǎn)量高的單克隆抗體是當前各有關(guān)實驗室研究的重要問題，通常用于生產(chǎn)單克隆抗體的方法有兩種：①利用純系小鼠生產(chǎn)免疫腹水，該法的優(yōu)點是產(chǎn)量和效價高，但純化困難，價格昂貴，生產(chǎn)周期長；②雜交瘤細胞常規(guī)體外培養(yǎng)法，此法雖然產(chǎn)量不價低，但不含正常小鼠免疫球蛋白，較易純化且成本低，但此法若需大量生產(chǎn)則需特殊設(shè)備［2］。近有人報道用雜交瘤細胞培養(yǎng)也可提高單克隆抗體的產(chǎn)量且方法簡便［3］。經(jīng)我們對3株抗人衰變加速因子（Decay-Accelerating Factor，DAF，CD55）單克隆抗體的制備和產(chǎn)量測定，獲得較為滿意的結(jié)果，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 純化抗原及抗體 純化的可溶性重組DAF由英國Reading大學Goodfellow博士惠贈?？谷薉AF單克隆抗體IC6培養(yǎng)上清（1μg／ml）由日本Fukushima醫(yī)學院Fujita博士惠贈。辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG（工作濃度1∶1000），購自中山生物制品有限公司。

1.2 培養(yǎng)基 RPMI 1640（Gibco產(chǎn)品），含2mmol L-谷氨酰胺，100U／ml青霉素，100μg／ml鏈霉素和10％FCS。

1.3 雜交瘤細胞系 DA11、DG3、DG9雜交瘤細胞均由本實驗室建立，經(jīng)SP2／0與免疫小鼠脾細胞融合篩選而成，抗體亞類均為IgG1，能穩(wěn)定分泌抗人DAF單克隆抗體［4］。

1.4 平臥式常規(guī)法培養(yǎng) 將DA11、DG3、DG9雜交瘤細胞用常規(guī)細胞培養(yǎng)法培養(yǎng)在25ml的方瓶中加培養(yǎng)液5ml，置37°C孵箱3～4d后，當瓶中只剩下少于5％有活力的細胞時離心收集上清，－20°C保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 直立式培養(yǎng) 將DA11、DG3、DG9雜交瘤細胞常規(guī)培養(yǎng)在平臥式細胞培養(yǎng)瓶中直到細胞密度達90％～95％時，補充培養(yǎng)液至瓶頸（總量為30ml），加橡皮塞直立式放置在37°C孵箱中，每天觀察細胞并晃動1次，可見死細胞不斷脫落至瓶底，活細胞繼續(xù)增殖，直到培養(yǎng)液變酸后離心收集上清，－20°C保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 標準曲線的制作 以不同濃度的IC6上清進行間接ELISA（具體步驟見1.7），每一濃度重復3孔，測得OD值，進行回歸分析，繪制標準曲線。

1.7 單克隆抗體含量測定 采用間接ELISA法，具體步驟如下：（1）包被純化人DAF于96孔ELISA板，50μl／孔，4°C，18～24h。（2）用0.02M PBS＋0.05％Tween20（PBS-T）將板孔洗3次，3min／次，空干，加入不同濃度的鼠抗人DAF單克隆抗體上清，50μl／孔，37°C孵育50min。（3）同上洗滌，加入1∶1000羊抗鼠IgG酶標抗體，50μl／孔，37°C，50min。（4）同上洗滌，加入鄰苯二胺-H2O2溶液37°C顯色20min后，在BIO-RAD Model 3550自動酶聯(lián)檢測儀上選擇490nm測OD值。平臥式與直立式培養(yǎng)收獲的上清及IC6上清同時進行試驗，以SP2／0骨髓瘤細胞上清作為陰性對照。根據(jù)標準曲線計算每種樣品中的單抗含量。

2 結(jié)果與討論

經(jīng)統(tǒng)計學處理抗人DAF單克隆抗體IC6上清濃度在0．001～0．1μg／ml之間時，其含量與OD值呈線性關(guān)系（見圖1）。分別將平臥式和直立式收獲的

 

圖 1 IC6上清標準曲線

Fig 1Standard curves of supernatant of IC6

細胞培養(yǎng)上清用間接ELISA法測定其效價及含量，結(jié)果3株雜交瘤細胞產(chǎn)生的抗人DAF單克隆抗體，其直立式培養(yǎng)上清的OD值均略高于平臥式培養(yǎng)的上清，將3株單克隆抗體的OD值從標準曲線上查得其含量，結(jié)果見表1。直立式比平臥式產(chǎn)量提高8～14倍，與Susan等的結(jié)果相符。直立式的特點是培養(yǎng)液用量多，且在生長過程中死亡細胞不斷脫落至瓶底，

表1 平臥式與直立式培養(yǎng)單抗產(chǎn)量比較

Tab 1 Production of mAbs in horizontal and standing flask methods

Cell line    Horizontal culture    Standing culture
Ig concentration
（μg／ml）

Total yiele
（μg／falsk）

Ig concentration
（μg／ml）

Total yiele
（μg／falsk）

DG3    22．97    114．85    35．89    1076．7
DG9    26．31    131．55    37．14    1114．2
DA11    26．91    134．55    65．45    1963．5
使培養(yǎng)瓶留出更多的空間供活細胞生長而繼續(xù)分泌抗體；平臥式培養(yǎng)，則死亡細胞占據(jù)空間影響活細胞的分裂增殖，需傳代后方能繼續(xù)增殖，增加污染機會及工作量。

由于本法無需特殊設(shè)備、簡便易行、節(jié)省人力物力，減少污染機會，一般實驗室可推廣應用。作者：女，37歲，本科，實驗師

參考文獻

1 陸德源.現(xiàn)代免疫學.上海：上?？萍汲霭嫔?，1995.35

2 Jaspert R，Geske T，Teichmann A，et al．Laboratory scale production of monoclonal antibodies in a tumbling chamber．J Immunol Methods，1995，178：77

3 Susan Ker hwe Ou，Paul HP，Terson T．A more efficient and economical approach for monclonal antibody production．J Immunol Methods，1997，209：105

4 鄒 強，謝佩蓉，鄭 萍.抗人DAF單克隆抗體的制備及鑒定.免疫學雜志，1999，15（2）：122