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免疫沉淀
閱讀：502 發(fā)布時(shí)間：2018-9-12疫沉淀是利用特異性抗體識(shí)別并分離抗原的方法。
材料：
上樣buffer的配方(用前現(xiàn)配):
2ul 1.25M Tris-HCL , pH 6.8
35ul distilled water
2.5ul 2-mercaptoethanol
12.5ul 10%SDS
10ul 80% glycerol
2ul bromphenol blue
TNE buffer:
10mM Tris-HCl pH 8.0
10mM NaCl
0.5mM EDTA
方法：
1．用含有1% NP40的緩沖液重懸細(xì)胞，充分振蕩。
2．在冰上孵育30分鐘或37℃孵育10—15分鐘
3．轉(zhuǎn)入eppendorf管中離心3分鐘
4．將上清輕輕倒入一干凈試管，加入40—50 ul抗血清
5．冰上孵育2小時(shí)或4℃過夜
6．在TNE中加入100ul SPA 和100ul 5% BSA
7．冰上孵育2小時(shí)
8．離心使免疫復(fù)合物成球，用1ml含1%NP40,0.5% Na deoxychloate, 0.1% SDS 的TNE,在用超聲波重懸
9．加入70ul的上樣緩沖液，振蕩。
10．熱水中水浴90秒，離心1分鐘，保留上清。
11．若不立即實(shí)驗(yàn)請低溫保存。
（以上資料僅供參考）
免疫細(xì)胞化學(xué)：
1．在無菌消毒的6孔板中加入100，000個(gè)/孔細(xì)胞，過夜
2．倒掉上清，用PBS洗滌一次后立即加入-20°C的甲醇（注意不要讓細(xì)胞干掉），再將板置于-20°C冰箱5分鐘，然后倒掉甲醇加入PHEM 緩沖液，置于4°C。
3．加入含合適血清（2.5—5%）的PHEM 緩沖液輕微振搖一小時(shí)
4．加入一抗至封板緩沖液，輕微振搖孵育一小時(shí)
5．倒掉封板液，加入PHEM 緩沖液洗滌4次，每次10分鐘
6．加入二抗至封板緩沖液，輕微振搖孵育半小時(shí)
7．倒掉封板液，加入PHEM 緩沖液洗滌4次，每次10分鐘
8．用鑷子夾起 coverslip，輕輕去除過多的緩沖液，加入約20ul“antifade”, 輕輕蓋上coverslip, 去掉過多的”antifade” 后置于-20°C避光保存。
試劑配方：
PHEM 緩沖液：:
25 mM HEPES
10 mM EGTA
60 mM PIPES
2 mM MgCl2
pH = 6.9
（請以此順序加入）
Antifade: 1 ml
1 mg p-phenylene diamine hydrochloride 溶解在 0.1 ml 10x PBS (20 min 室溫)
加入 0.9 ml 100% 甘油，封閉保存不要振搖。
若顏色變成棕色，請不要用了。分裝保存在-70 °C