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原位末端轉移酶標記技術檢測凋亡
閱讀：490 發(fā)布時間：2018-8-8（一）原理
凋亡細胞是由于內源性核酸內切酶的激活后，將DNA切割成許多雙鏈DNA段以及高分子量DNA單鏈斷裂點（缺口），暴露出大量3-羥基末端，如用末端脫氧核苷酸轉移酶（TdT）將標記的dUTP進行缺口末端標記，則可原位特異地顯示出凋亡細胞。主要應用的是熒光標記法和酶標記法。
（二）熒光標記法
1．材料與試劑 采用德國Boehringer-Mannheim公司In Situ Cell Death Detection 試劑盒，或美國Oncor公司ApopTagTM試劑盒，包括：
⑴生物素標記的-Dutp(Biotin-dUTP)或標記的-dUTP(Digoxingeningll-dUTP)１nmol/µl
⑵ TdT酶（25U/μl）
⑶ 反應緩沖液
⑷ 洗滌緩沖液
⑸ 異硫氰酸熒光素（FITC）標記的親合素或鏈霉親合素（2.5µg/ml）或抗抗體（1︰30）
⑹ PI染液（含PI 5µg/ml及無DNA酶活性的RNA酶0.1%）
⑺ PBS緩沖液
⑻ 塑料蓋玻片
2.樣品
⑴ 懸浮生長培養(yǎng)細胞的甩片或涂片
⑵ 貼壁生長的培養(yǎng)細胞
⑶ 冰凍切片
⑷ 常規(guī)石蠟切片
3.操作方法
（1）固定：培養(yǎng)細胞的制片或冰凍切片用4%多聚甲醛固定30min(4℃)后，用80%酒精再固定2h（-20℃）。常規(guī)4%中性福爾馬林固定、石蠟包埋之切片進行脫蠟、水化。
（2）洗滌：玻片浸入PBS緩沖液，搖床上洗滌5min,三次。
（3）反應：洗滌后的玻片用吸水紙吸干細胞或組織周圍水分，按50μl/㎝2滴加反應液（每50μl反應液含TdT酶0.5μl,標記的-dUTP 1μl）,使反應液均勻地覆蓋于所有細胞或組織切片上,蓋上塑料蓋玻片,置濕盒中,37℃孵育1h。
（4）終止反應：去掉塑料蓋玻片，將玻片置盛有洗滌緩沖液的染色缸內，洗滌兩次，每次5min。
（5）FITC標記：洗滌后的玻片用吸水紙吸去細胞或組織周圍水分，按50μl/㎝2滴加FITC反應液（含FITC 2.5μg/ml），室溫下避光孵育10min。
（6）洗滌：將玻片置于洗滌緩沖液內，洗兩次，每次5min。
（7）PI復染：將玻片置于盛有PI染液的染色缸內，室溫下避光染色30min。
（8）封片：用蓋玻片直接蓋在含PI染液的玻片上，亦可用無色指甲油涂于蓋玻片四周邊緣，置暗盒中，盡早鏡檢觀察。
4.結果判定：用熒光顯微鏡觀察，選用藍色激發(fā)光（波長488nm），所有的細胞核均被PI著色，顯示出紅色熒光，而凋亡細胞被特異地標記上FITC，顯示出黃綠色熒光。
(三)酶標記法
1.材料與試劑 采用美國Oncor公司ApopTagTM-Peroxidase試劑盒，包括：
⑴ 過氧化物酶標記的抗抗體
⑵ 反應緩沖液
⑶ TdT酶
⑷ 反應終止/洗滌液
⑸ 平衡緩沖液
⑹ 蛋白酶K消化液：20μg/ml蛋白酶K溶于PBS。
⑺ 30% H2O2
⑻ DAB顯色液：0.05%的diaminobenzidine(DAB)溶于PBS，用前過濾并加入
0.02% H2O2。
⑼ 甲基綠染液：0.5%甲基綠溶于0.1Mol/L枸櫞酸鈉，pH調整到4.0。
⑽ 塑料蓋玻片及玻璃蓋玻片
2．樣品 同熒光標記法。
3．操作方法
⑴ 固定：同熒光標記法。
⑵ 內源性過氧化物封閉 玻片置于盛有0.5% H2O2緩沖溶液的染色缸內，室溫下作用20min后，同熒光標記法洗滌。
⑶ 消化：玻片浸于盛有蛋白酶K消化液的染色缸，室溫下消化15min，洗滌
同上。
⑷ 平衡處理：將細胞或組織周圍液體用吸水紙吸干，滴加平衡緩沖液（按70µl／cm2）覆蓋細胞或組織表面，蓋上塑料蓋玻片，室溫下作用5min～10min。
⑸ 反應：移去蓋玻片，傾去平衡液，用吸水紙吸干周圍液體，滴加反應液（按50µl/㎝2，18μl TdT酶 36μl反應緩沖液），均勻覆蓋在細胞或組織上，蓋上塑料蓋玻片，置于濕盒中，37℃溫育1h。
⑹ 終止反應：移去蓋玻片，將玻片置于盛有終止/洗滌液的染色缸內，37℃下洗滌30min（置搖床上振搖）。然后將玻片置于洗滌緩沖液內，洗兩次，每次5min。
⑺ 抗體反應：用吸水紙吸干細胞或組織周圍液體，滴加70μl過氧化物酶標記的抗體，均勻覆蓋，加上塑料蓋玻片，室溫下置于濕盒中，孵育30min。
⑻ 洗滌：置于洗滌緩沖液內，洗兩次，每次5min。
⑼ 用吸水紙吸干細胞或組織周圍液體，滴加新鮮配制的DAB顯色液，均勻覆蓋，加上塑料蓋玻片，室溫下作用3min～6min。
⑽ 洗滌：置于蒸餾水中洗滌3次，每次3min～6min。
⑾ 套染：將玻片置于盛有甲基綠染液的染色缸中，室溫染色10min。
⑿ 洗滌：蒸餾水洗滌3次（置于搖床上），每次2min。
⒀ 脫水、封片：100%正丁醇，3次，每次2min。二甲苯，3次，每次2min。
明膠甘油封片。
4．結果判定 光學顯微鏡下觀察，所有的細胞核均著綠色，凋亡的細胞核染色質顯示出特異性的棕黃色。
該文章轉自生物在線