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蛋白質提取的好辦法
閱讀：581 發(fā)布時間：2018-8-7你試一試這兩種方法:
種：
1）將細胞系放在冰上
2）去除上清，用pH7。4的冷磷酸鹽緩沖液洗滌單層細胞兩次
3）加入1ml2%TritonX溶液冰浴15min
4)刮下單層細胞，4度下10 000g 5min離心
5）溶液37度水浴 10min以分離水相和去污劑相，然后37度下2 000g離心5min
6)收集水相留作分析
7）用500ul冰冷的buffer C溶解去污劑相沉淀，冰浴2min后加溫，在按步驟6再次離心
8）按步驟8再次抽提去污劑相，用buffer C將洗滌后的去污劑相稀釋到初始體積
9）用等量的buffer A分別稀釋水相與去污相，并進行免疫沉淀實驗
試劑：
1）2%tritonX114:2%TritonX114、50mmol/L Tris HCl（pH7。5）、蛋白酶抑制劑
2）緩沖液A（含0。5mol/LNaCl的RIPA buffer)
3)buffer C
10mmol/L Tris HCl(pH7.5)
150mmol/L NaCl
5mmol/L EDTA(PH7.5)
第二種方法：
液氮研磨組織，組織100倍量預冷的緩沖液A（10mmol/L Tris-HCL,320nmol/L 蔗糖，PH7.4，臨用前加1mM的PMSF）；離心，每次10S×2，間隔20S，強度50，700g（4900rps），4度，10分鐘。取上清，將此上清，37000g（18100rps），4度，40分鐘，棄上清，取沉淀。用緩沖液B（A去掉蔗糖PH7.，臨用前加1mM的PMSF）重新混懸。