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應(yīng)用細(xì)胞融合技術(shù)制備染色體提前凝集標(biāo)本
閱讀：389 發(fā)布時(shí)間：2018-7-19實(shí)驗(yàn)原理
在自然條件下或用人工的方法(物理、化學(xué)或生物)將兩個(gè)或兩個(gè)以上的同種或不同種細(xì)胞融合成一個(gè)細(xì)胞的過(guò)程稱(chēng)為細(xì)胞融合。
七十年代初，由于發(fā)現(xiàn)M 期細(xì)胞內(nèi)有某種促進(jìn)染色體凝集因子，它無(wú)種屬特異性，所以在細(xì)胞融合和染色體技術(shù)的基礎(chǔ)上，建立了制備染色體提前凝集標(biāo)本的方法。即讓M 期細(xì)胞與間期(I 期)細(xì)胞融合，從而誘導(dǎo)I 期細(xì)胞染色質(zhì)提前濃縮成染色體。形成的這種染色體稱(chēng)提前凝集的染色體(Prematurely Condensed Chromosome， PCC)。這項(xiàng)技術(shù)已應(yīng)用于細(xì)胞周期分析、正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞染色體的微細(xì)結(jié)構(gòu)的研究、多種因素作用細(xì)胞使染色體損傷及修復(fù)效應(yīng)的研究，預(yù)測(cè)某種血液病的病程、愈后及復(fù)發(fā)的臨床實(shí)踐等方面。
實(shí)驗(yàn)試劑
1. 50％PEG
2. Hanks 液(pH7.4)
3. RPMI－1640 培養(yǎng)基(含10％滅活小牛血清，pH7.4)
4. 10ug/ml秋水仙素
5. 0.075mol/L KCl 低滲液
6. 0.2％次甲基蘭染液
7. 1/15mol/L PBS
8. Carnoy 固定液
9. Giemsa 染液
實(shí)驗(yàn)設(shè)備
1. 光學(xué)顯微鏡
2. 離心機(jī)
3. 水浴箱
4. 熱吹風(fēng)機(jī)
5. 10ml 刻度離心管
6. 5 號(hào)針頭注射器
7. 試管架
8. 試管夾
9. 染色槽
10. 廢液缸
11. 冰凍載玻片
12. 吸水紙
13. 擦鏡紙
14. 香柏油瓶
15. 記號(hào)筆
16. 酒精燈
實(shí)驗(yàn)材料
人宮頸癌上皮細(xì)胞(Hela 細(xì)胞)
實(shí)驗(yàn)步驟
1. 收集培養(yǎng)的M 期Hela 細(xì)胞
1) 取一瓶處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Hela 細(xì)胞，向培養(yǎng)基中加入10ug/ml 的秋水仙素使終濃度為0.04ug/ml。
2) 在37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)12h，使大量生長(zhǎng)的細(xì)胞被阻斷于M 期。
3) 每組取一瓶經(jīng)上述處理的細(xì)胞，以平行于細(xì)胞生長(zhǎng)面方向反復(fù)振搖，使培養(yǎng)液不斷沖刷細(xì)胞層(或用吸管吹打)，M 期細(xì)胞因變成球形容易脫離瓶壁而懸浮。
4) 將含有M 期細(xì)胞的培養(yǎng)基移入離心管中，1000rpm 離心5min。
5) 棄去上清，加入5ml Hanks 液，用吸管吹打成細(xì)胞懸液。
2. 收集培養(yǎng)的Hela 細(xì)胞
1) 取一瓶生長(zhǎng)良好的Hela 細(xì)胞，棄去培養(yǎng)基。
2) 加入少量0.25％的胰蛋白酶消化2-3min，棄去胰酶消化液。
3) 加入5ml Hanks 液，用吸管吹打成單個(gè)懸浮細(xì)胞備用。
3. 50％ PEG 的制備
1) 稱(chēng)取0.5g PEG(MW 4,000)，倒入離心管中。
2) 在酒精燈上加熱使之融化(約為0.5ml)。
3) 再加入預(yù)熱的Hanks 液0.5ml，混勻，置37℃水浴中待用。
4. 細(xì)胞融合
1) 將上述兩管細(xì)胞倒入一個(gè)離心管中充分混勻。1000rpm 離心5min，棄上清，再小心地吸盡殘液。
2) 用指彈法彈散細(xì)胞，在37℃水浴條件下吸取0.5ml 50％ PEG，逐滴加入離心管中，并不斷地輕輕搖動(dòng)，整個(gè)過(guò)程約90 秒鐘。然后，迅速加入5ml Hanks 液以終止PEG 的作用。在37℃水浴中靜置5min。
3) 1000rpm 離心5min，棄上清，加入2ml 含有血清的RPML-1640 培養(yǎng)基，同時(shí)用5 號(hào)針頭的注射器垂直加入10ug/ml 的秋水仙素1 滴，輕輕吹打成懸液，37℃水浴中溫育30～60min。
5. 制備PCC 標(biāo)本
1) 細(xì)胞溫育后，以1000rpm 離心5min，棄上清，加入10ml 0.075mol/L KCL 低滲液輕輕制成懸液。
2) 在37℃處理25min 左右，終止時(shí)加入1ml Carnoy 固定液進(jìn)行固定。
3) 1000rpm 離心8min，棄上清，指彈離心管底部使細(xì)胞分散，加入10ml Carnoy 固定液固定30min。
4) 1000rpm 離心5min，棄去上清，留0.2ml 殘液，用吸管輕輕吹打成懸液。
5) 取預(yù)冷的載玻片，制一張滴片，烤干。
6) Giemsa 染色15min 左右，水洗，干燥后鏡檢。