犬CRP ELISA是一種高靈敏度的雙位點(diǎn)酶聯(lián)免疫測(cè)定法（ELISA），用于犬血清和血漿樣本中C-反應(yīng)蛋白（CRP）的測(cè)定。

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犬C-反應(yīng)蛋白ELISA檢測(cè)原理：

雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）的原理如圖1所示。在這種測(cè)定中，樣品中的C反應(yīng)蛋白（CRP）與已吸附到聚苯乙烯微孔板表面的抗CRP抗體發(fā)生反應(yīng)。通過(guò)洗滌去除未結(jié)合的蛋白質(zhì)后，加入辣根過(guò)氧化物酶（HRP）偶聯(lián)的抗CRP抗體。這些酶標(biāo)記的抗體與之前結(jié)合的CRP形成復(fù)合物。經(jīng)過(guò)再次洗滌后，通過(guò)添加顯色底物3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）來(lái)測(cè)定與免疫吸附劑結(jié)合的酶。結(jié)合的酶量與測(cè)試樣品中CRP的濃度成正比；因此，450納米處的吸光度是測(cè)試樣品中CRP濃度的量度。測(cè)試樣品中CRP的量可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線中插值得出，并根據(jù)樣品稀釋進(jìn)行校正。

樣品收集和處理

所有血液成分和生物材料應(yīng)視為潛在危險(xiǎn)。處理和處置時(shí)遵循通用預(yù)防措施。如果血液樣品出現(xiàn)凝塊、嚴(yán)重溶血、脂血或樣品完整性受到質(zhì)疑，請(qǐng)記錄并謹(jǐn)慎解釋結(jié)果。以下列出的樣品收集和儲(chǔ)存條件僅供參考。樣品穩(wěn)定性尚未評(píng)估。

? 血清樣品 - 應(yīng)通過(guò)靜脈穿刺收集血液。血凝后通過(guò)離心分離血清。取出血清立即進(jìn)行測(cè)定或分裝后儲(chǔ)存于-80°C（最好）或-20°C。避免反復(fù)凍融。

? 血漿樣品 - 應(yīng)將血液收集到含有抗凝劑的容器中，然后進(jìn)行離心。立即進(jìn)行測(cè)定或分裝后儲(chǔ)存于-80°C（最好）或-20°C。避免反復(fù)凍融。

? 已知干擾物質(zhì) - 濃度高于0.1%的疊氮化物和硫柳汞會(huì)抑制酶反應(yīng)。

樣品稀釋

定量測(cè)定樣品中CRP的測(cè)定要求每個(gè)測(cè)試樣品在使用前進(jìn)行稀釋。每次進(jìn)行測(cè)定時(shí)，所有樣品都應(yīng)以雙份進(jìn)行測(cè)定。推薦的稀釋比例僅供參考。稀釋比例應(yīng)基于未知樣品的預(yù)期濃度，以便稀釋后的樣品落在標(biāo)準(zhǔn)曲線的動(dòng)態(tài)范圍內(nèi)。如果不確定樣品水平，在運(yùn)行整個(gè)板之前，強(qiáng)烈建議對(duì)一個(gè)或兩個(gè)代表性樣品進(jìn)行系列稀釋。

血清和血漿樣品 - 推薦的起始稀釋比例是1:1000。要制備1:1000的樣品稀釋液，將5 ?L的樣品轉(zhuǎn)移到495 ?L的1X工作稀釋液中。這會(huì)產(chǎn)生1:100的稀釋比例。接下來(lái)，將1:100的樣品通過(guò)將40 ?L轉(zhuǎn)移到360 ?L的1X工作稀釋液中進(jìn)行稀釋。這會(huì)產(chǎn)生1:1000的樣品稀釋比例。每個(gè)階段都要C底混合。

試劑準(zhǔn)備

使用前將所有試劑置于室溫（16°C至25°C）。

稀釋液濃縮物 - 提供的稀釋液為5倍濃縮液，必須用蒸餾水或去離子水（1份緩沖液濃縮物，4份dH2O）按1:5稀釋。

洗滌液濃縮物 - 提供的洗滌液為20倍濃縮液，必須用蒸餾水或去離子水（1份緩沖液濃縮物，19份dH2O）按1:20稀釋。濃縮物在低溫儲(chǔ)存時(shí)可能會(huì)形成晶體。稀釋前將濃縮物加熱至30-35°C可以溶解晶體。

酶-抗體結(jié)合物 - 通過(guò)向每個(gè)微孔板測(cè)試條使用的1X工作稀釋液中添加10 ?L酶-抗體結(jié)合物和990 ?L來(lái)計(jì)算每個(gè)微孔板測(cè)試條所需的1X工作結(jié)合物溶液量。均勻混合，但要輕柔。避免產(chǎn)生泡沫。

預(yù)包被ELISA微孔板 - 按提供的狀態(tài)使用。打開(kāi)微孔板袋，從袋中取出板。取出在測(cè)定中不會(huì)使用的所有條和孔，放回袋中并重新密封，同時(shí)放回干燥劑。

結(jié)果計(jì)算

1. 從每個(gè)孔的值中減去平均背景值（標(biāo)準(zhǔn)零的平均吸光度讀數(shù)）。

2. 對(duì)每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的平均重復(fù)讀數(shù)進(jìn)行平均，并使用結(jié)果構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過(guò)使用能夠生成四參數(shù)邏輯曲線擬合的計(jì)算機(jī)軟件來(lái)減少數(shù)據(jù)來(lái)構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。也可以使用二次多項(xiàng)式（二次）或其他曲線擬合；然而，它們對(duì)數(shù)據(jù)的擬合精度會(huì)較低。

3. 從標(biāo)準(zhǔn)曲線中插值得到測(cè)試樣品值。校正血清稀釋因子，以得出原始樣品中的CRP濃度。

ALPCO產(chǎn)品種類(lèi)多樣，可測(cè)樣品來(lái)源包括人、大/小鼠、豚鼠、兔、豬、羊、狗、猴等，涉及神經(jīng)生物學(xué)、骨代謝、心血管疾病和氧化應(yīng)激、細(xì)胞因子與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、糖尿病和肥胖癥、內(nèi)分泌學(xué)、甲狀腺功能、腸胃病學(xué)、免疫學(xué)、生殖激素、抗體和抗原、分子診斷等多個(gè)研究領(lǐng)域，尤以糖尿病和肥胖癥研究領(lǐng)域見(jiàn)長(zhǎng)。

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