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《生物多樣性研究基金》申報(bào)通知

基本信息

主題：TRPV4（一種NSCC）通過(guò)硬骨魚(yú)催產(chǎn)素途徑調(diào)節(jié)斑馬魚(yú)離子平衡

期刊：Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol

影響因子：3.176

研究使用平臺(tái)：NMT斑馬魚(yú)創(chuàng)新科研平臺(tái)

標(biāo)題：Transient receptor potential vanilloid 4 modulates ion balance through the isotocin pathway in zebrafish (Danio rerio)

作者：中國(guó)臺(tái)灣師范大學(xué)林豊益、劉咸臺(tái)

檢測(cè)離子/分子指標(biāo)

H⁺

檢測(cè)樣品

斑馬魚(yú)卵黃囊的H⁺-ATPase富集細(xì)胞（HR細(xì)胞）

中文摘要（谷歌機(jī)翻）

—硬骨魚(yú)催產(chǎn)素通過(guò)調(diào)節(jié)離子細(xì)胞（也稱(chēng)為富線粒體細(xì)胞或氯化物細(xì)胞）的功能來(lái)控制離子調(diào)節(jié)。但是，關(guān)于硬骨魚(yú)催產(chǎn)素蛋白系統(tǒng)的上游分子知之甚少。在本文中，我們確定了瞬態(tài)受體電位香草酸4（TRPV4），其調(diào)節(jié)硬骨魚(yú)催產(chǎn)素的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)并通過(guò)硬骨魚(yú)催產(chǎn)素途徑影響離子調(diào)控。雙重免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，TRPV4在成年斑馬魚(yú)腦下丘腦的同種異能神經(jīng)元中表達(dá)。為了進(jìn)一步闡明TRPV4的作用，我們操縱了TRPV4蛋白的表達(dá)并評(píng)估了其在斑馬魚(yú)胚胎中的離子調(diào)節(jié)功能。用嗎啉代寡核苷酸敲低TRPV4基因可降低整個(gè)幼蟲(chóng)的離子含量（Na⁺，Cl^-和Ca²⁺）和斑馬魚(yú)幼體皮膚的H⁺分泌功能。在TRPV4突變體中，也抑制了離子細(xì)胞相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的mRNA表達(dá)，包括H+-ATPase，上皮Ca²⁺通道和Na-Cl協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。TRPV4敲除后，斑馬魚(yú)幼蟲(chóng)皮膚中的離子細(xì)胞（富含H+-ATPase的細(xì)胞和富含Na-K-ATPase的細(xì)胞）和表皮干細(xì)胞的數(shù)量也減少了。我們的結(jié)果表明，TRPV4通過(guò)硬骨魚(yú)催產(chǎn)素途徑調(diào)節(jié)離子平衡。

離子/分子流實(shí)驗(yàn)處理方法

對(duì)受精后三天的斑馬魚(yú)進(jìn)行TRPV4敲除。

離子/分子流實(shí)驗(yàn)結(jié)果

通過(guò)NMT分析了斑馬魚(yú)幼體卵黃囊的酸分泌。在卵黃囊表面記錄到了代表酸分泌的H⁺外排。在TRPV4突變體中酸分泌分別下降了21.9％和67.6％，這表明卵黃囊（左圖）和HR的細(xì)胞（右圖）的酸分泌受到抑制。

其他實(shí)驗(yàn)結(jié)果

• TRPV4是由斑馬魚(yú)大腦中的isotocinergic神經(jīng)元表達(dá)的

• Western blot分析表明，在對(duì)照組中，抗TRPV4抗體識(shí)別出一條98kda的TRPV4蛋白帶。在0.5ng TRPV4-嗎啉修飾反義寡核苷酸1（MO1）突變體中，該條帶較微弱。表明TRPV4蛋白表達(dá)受trpv4 MO1的抑制

• 在TRPV4突變體中，同位素的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)均顯著降低

• 注射TRPV4MO 可顯著降低斑馬魚(yú)胚胎的離子含量

• 用RT-qPCR法檢測(cè)了trpv4突變體中H⁺-ATPase（HA）、上皮Ca²⁺通道（ECaC）和Na⁺-Cl^-共轉(zhuǎn)運(yùn)體（NCC）的mRNA表達(dá)，發(fā)現(xiàn)HA、ECaC和NCC基因表達(dá)分別下降了39%、42%和62%。

• TRVP4突變體中HR、Na⁺-K⁺-TAPase-rich（NaR）細(xì)胞和P63細(xì)胞密度均降低，表明TRPV4基因敲除了降低了表皮干細(xì)胞的數(shù)量。

結(jié)論

在本研究中，我們*證明，TRPV4由斑馬魚(yú)下丘腦中的同位素神經(jīng)元表達(dá)。TRPV4表達(dá)功能的喪失降低了同位素mRNA和蛋白表達(dá)，并減少了表皮干細(xì)胞和離子細(xì)胞的數(shù)量。我們還觀察到在TRPV4突變體中離子細(xì)胞的功能被下調(diào)。我們的研究結(jié)果表明TRPV4充當(dāng)調(diào)節(jié)硬骨魚(yú)催產(chǎn)素功能的上游分子。

離子流實(shí)驗(yàn)使用的測(cè)試液

Normal water, 300μMMOPS buffer, 0.1 mg/L ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate，pH7.0