德國(guó)picotweezers品牌，高分辨率三維單細(xì)胞單分子力學(xué)捕獲分析光鑷系統(tǒng)(3D Force Sensitive Optical Tweezers)
PicoTweezers是一種結(jié)合了光鑷技術(shù)及微視圖像計(jì)算集合的分子生物力學(xué)分析系統(tǒng)。PicoTweezers作為一個(gè)獨(dú)立的系統(tǒng)，可以與蔡司Axiovert、AxioA1或D1顯微鏡聯(lián)合使用。PicoTweezers配備了功率為1W或5W的紅外光纖激光器，可達(dá)激光陷阱捕獲力范圍是400pN——2nN。PicoTweezers的3D-壓電平臺(tái)可以實(shí)現(xiàn)x軸和y軸為200μn;m的分辨率，在z軸方向可以實(shí)現(xiàn)20μn;m的分辨率。*的視頻分析系統(tǒng)（Video-analysis）可以達(dá)到至少2.5納米的橫向和軸向分辨率，其圖像拍攝速率為200幀/秒，X、Y、Z互相成像速度為400赫茲，可對(duì)生物大分子進(jìn)行0.1PN作用力分辨率的實(shí)時(shí)分析。
圖1 PicoTweezers裝配示意圖
系統(tǒng)工作原理：
分子之間的作用力是在三維方向上分布的，所以為了計(jì)算大分子之間產(chǎn)生的各種作用力，需要在X、Y、Z三個(gè)維度上進(jìn)行作用力的精確檢測(cè)，并且要求在這三個(gè)維度的測(cè)量空間比較大，以實(shí)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)的自由度和多目的性。
PicoTweezers系統(tǒng)使用視頻分析系統(tǒng)（右下圖）作為粒子追蹤、檢測(cè)和力測(cè)量的系統(tǒng)，該系統(tǒng)雖然相對(duì)復(fù)雜，但模塊化的配置和穩(wěn)定的組裝賦予了該系統(tǒng)易于使用的特征。
在測(cè)量的過(guò)程中，被光阱捕獲的顆粒會(huì)在三個(gè)方向上對(duì)光進(jìn)行阻擋，導(dǎo)致光線偏轉(zhuǎn)，PicoTweezers的視頻分析系統(tǒng)通過(guò)獲取偏轉(zhuǎn)的圖像來(lái)分析作用力的變化，進(jìn)而可以分析分子之間作用力的變化。由于該系統(tǒng)非常穩(wěn)定，且不需要校準(zhǔn)、沒(méi)有試驗(yàn)和空間的限制，所以該系統(tǒng)應(yīng)用領(lǐng)域非常廣泛，是生物學(xué)、分子生物學(xué)、材料學(xué)研究者在大分子生物力學(xué)研究中的進(jìn)實(shí)驗(yàn)儀器之一。
系統(tǒng)擁有自動(dòng)、簡(jiǎn)單和可靠的力校準(zhǔn)系統(tǒng)
該系統(tǒng)在三維空間中的力校準(zhǔn)是通過(guò)斯托克斯阻力法移動(dòng)3D-壓電平臺(tái)周邊的介質(zhì)來(lái)進(jìn)行的。在具體的應(yīng)用中，作用力的檢測(cè)是通過(guò)基于視頻的Allan方差分析和校準(zhǔn)途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)的，其過(guò)程主要是通過(guò)對(duì)微小粒子的波動(dòng)進(jìn)行圖像記錄和分析，在此過(guò)程中，不需要施加任何摩擦力。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，斯托克斯方法和Allan方差都不需要對(duì)光阱剛度k進(jìn)行判定，即使需要，視頻分析軟件可以自動(dòng)進(jìn)行計(jì)算。
系統(tǒng)的計(jì)算原理
系統(tǒng)擁有兩臺(tái)高速數(shù)碼照相機(jī)。臺(tái)照相機(jī)對(duì)光學(xué)阱捕獲的粒子的周圍區(qū)域進(jìn)行成像，第二臺(tái)高速CMOS照相機(jī)對(duì)被放大的粒子大圖像進(jìn)行測(cè)量。相關(guān)的關(guān)鍵會(huì)實(shí)時(shí)分辨并鎖定每個(gè)幀圖像的邊緣部分，確定出圖像的灰階和合適的范圍，以此來(lái)確定或獲取粒子的直徑。
當(dāng)外在的作用力施加在粒子上面時(shí)導(dǎo)致粒子在Z-軸上發(fā)生位移時(shí)，粒子的直徑會(huì)發(fā)生變化，軟件會(huì)將這種變化通過(guò)Z-軸的作用力表現(xiàn)出來(lái)。而粒子受到水平方向上的作用力時(shí)，僅僅改變圖像的圓心的位置，但是其直徑并不會(huì)改變。這樣通過(guò)獲取圖像的位置的變化就可以分析粒子納米級(jí)別的水平方向受到的作用力，進(jìn)而分析出粒子在X、Y軸上所受到的作用力。
粒子在Z-軸上作用力會(huì)改變圖像的直徑，在X、Y軸上所受到的作用力會(huì)改變圖像的圓心位置
力測(cè)量的三種方式對(duì)比：
左邊：是傳統(tǒng)光鑷的監(jiān)測(cè)方法。激光通過(guò)捕獲粒子，然后收集前向散射光并投射到探測(cè)器感應(yīng)粒子的偏轉(zhuǎn)。由于獲取圖像之前需要設(shè)置冷卻器以進(jìn)行精確地調(diào)節(jié)，這種設(shè)置獲取的圖像容易漂移和錯(cuò)位，導(dǎo)致誤差；
中間：從顆粒被捕獲的目標(biāo)收集背散射光，入射激光設(shè)置分光器并投射到檢測(cè)器。這種方式測(cè)量的量程大，同樣可以建立基于視頻的檢測(cè)方法，但精確度不夠。
右邊：這是PicoTweezer的檢測(cè)方法，同樣也是通過(guò)設(shè)置并收集背散射光，然后通過(guò)分光器并投射到檢測(cè)器。但是PicoTweezer系統(tǒng)采用了高靈敏度的CMOS圖像傳感器進(jìn)行處理，并添加一組聚焦透鏡進(jìn)行圖像聚焦，從而可以實(shí)現(xiàn)對(duì)納米粒子圖像的更精確測(cè)定。其建立的基于圖像的檢測(cè)方法允許粒子更高的多樣性，數(shù)據(jù)吞吐速度更快，分析效果更精確。采用這種方法的優(yōu)勢(shì)之一是激光器和光阱之間的光學(xué)路徑無(wú)需對(duì)檢測(cè)器進(jìn)行校準(zhǔn)或調(diào)整，對(duì)于被監(jiān)測(cè)的對(duì)象粒子的直徑和移動(dòng)可以被長(zhǎng)期地監(jiān)測(cè)而不會(huì)發(fā)生漂移。
圖 光鑷子測(cè)量分子力的三種方式對(duì)比
圖PicoTweezers軟件工作界面
儀器亮點(diǎn)
1)定量在三維方向?qū)崿F(xiàn)0.1 PN分辨率下的3D測(cè)量
2)光阱捕獲力可在1 W光纖激光器下達(dá)到400 PN
3)通過(guò)光鑷實(shí)現(xiàn)對(duì)捕獲對(duì)象精度為納米級(jí)別的操控
4)擁有緊湊、超穩(wěn)定模塊化系統(tǒng)
5)可編程的LabVIEW?軟件界面
6)不需要檢測(cè)校準(zhǔn)，軟件計(jì)算非常容易
儀器應(yīng)用范圍
1.)單分子與活細(xì)胞的操控和分析
2)高分子彈性分析、微流控分析
3)分子相互作用、納米孔分析
應(yīng)用案例
1)單分子的捕獲及分析
單個(gè)DNA鏈通過(guò)兩端的官能基團(tuán)固定在兩個(gè)微珠之間。其中的一個(gè)微珠被玻璃微吸管固定，另外一個(gè)微珠被光鑷俘獲，通過(guò)移動(dòng)壓電平臺(tái)增加珠之間的距離引起的受控DNA的機(jī)械張力。作為響應(yīng)的分子的力 - 延伸曲線表現(xiàn)出DNA特定的機(jī)械性能，結(jié)果可以計(jì)算DNA的熵彈性，DNA的一個(gè)過(guò)渡延伸平臺(tái)區(qū)和熔融過(guò)渡區(qū)域。
圖DNA分子的捕獲及分析圖譜
2)單個(gè)DNA鏈的易位過(guò)程分析
PicoTweezers可用于納米孔分子生物學(xué)的研究，他們迅速演變成單分子檢測(cè)領(lǐng)域一個(gè)非常新穎的技術(shù)。當(dāng)單個(gè)DNA分子或DNA-蛋白復(fù)合物通過(guò)納米孔時(shí)，這個(gè)過(guò)程可以被PicoTweezers監(jiān)測(cè)并分析，相關(guān)數(shù)據(jù)可以確定DNA的易位動(dòng)力學(xué)和DNA上結(jié)合的蛋白質(zhì)的位置。
納米孔測(cè)量的優(yōu)勢(shì)主要表現(xiàn)在:(1)可在非常低的濃度和很小的樣品體積下測(cè)定目標(biāo)分子;(2)可同時(shí)進(jìn)行基因與生物標(biāo)志物的篩選;(3)由于不需要進(jìn)行放大及轉(zhuǎn)化,分析測(cè)量的速度將很快且費(fèi)用低廉。
當(dāng)捕獲的的粒子上的DNA接近納米孔（至5微米的距離）時(shí)，帶負(fù)電荷的DNA通過(guò)DNA骨架的靜電力立即進(jìn)入納米孔中，這種效果可以通過(guò)監(jiān)測(cè)的力信號(hào)得到?？梢钥吹竭@種作用力在到達(dá)一定穩(wěn)定值后突然變化，顯示出DNA的易位過(guò)程。系統(tǒng)所測(cè)得的力取決于施加的電壓以及納米孔的直徑。當(dāng)整個(gè)DNA鏈與納米孔另外一端的距離為10.5微米時(shí)，表明DNA鏈被拉出孔，所述力降回到零。
目前PicoTweezers可結(jié)合各個(gè)實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建的納米尺度裝置對(duì)單分子進(jìn)行分析。包括生物納米孔(通道) (由各類蛋白質(zhì)分子鑲崁在磷脂膜上組成)、固態(tài)納米孔(通道)(包括各種硅基材料、SiNx、碳納米管、石墨烯、玻璃納米管等)及兩類相結(jié)合的雜化納米孔(通道)。
圖 DNA的易位過(guò)程分析圖譜
3)單個(gè)DNA結(jié)合蛋白分析
當(dāng)結(jié)合到DNA鏈上的單個(gè)過(guò)氧氧化還原酶通過(guò)納米孔過(guò)程中，會(huì)發(fā)生非對(duì)稱的力的信號(hào)。這種信號(hào)可以作為蛋白質(zhì)在DNA上的結(jié)合位點(diǎn)的無(wú)標(biāo)記的定位信息。相關(guān)的力學(xué)信息結(jié)合DNA和蛋白質(zhì)的特征，可以進(jìn)一步得出其蛋白質(zhì)與DNA的結(jié)合作用力來(lái)源于蛋白質(zhì)與DNA骨架電荷的作用力。當(dāng)單個(gè)DNA結(jié)合蛋白通過(guò)納米孔時(shí)，DNA與結(jié)合蛋白之間的靜電引力減少，有助于分子通過(guò)微孔。
圖單個(gè)DNA結(jié)合蛋白分析圖譜
參考文獻(xiàn) S. Knust, A. Spiering, H. Vieker, A. Beyer, A. G?lzh?user, K. T?nsing, A. Sischka and D. Anselmetti Video-Based and Interference-Free Axial Force Detection and Analysis for Optical Tweezers Review of Scientific Instruments, 83, 103704 (2012) Spiering, S. Getfert, A. Sischka, P. Reimann and D. Anselmetti Nanopore Translocation Dynamics of a Single DNA-Bound Protein Nano Letters, 11, 2978 (2011) Sischka, A. Spiering, M. Khaksar, M. Laxa, J. K?nig, K.J. Dietz and D. Anselmetti Dynamic Translocation of Ligand-Complexed DNA Through Solid-State Nanopores with Optical Tweezers Journal of Physics - Condensed Matter, 22, 454121 (2010) Kleimann, A. Sischka, A. Spiering, K. T?nsing, N. Sewald, U. Diedrichsen and D. Anselmetti Binding Kinetics of Bisintercalator Triostin A with Optical Tweezers Force Mechanics Biophysical Journal, 97, 2780 (2009) Pla, A. Sischka, F. Albericio, M. Alvarez, X. Fernandez-Busquets and D. Anselmetti Optical-Tweezers Study of Topoisomerase Inhibition Small, 5, 1269 (2009) Sischka, C. Kleimann, W. Hachmann, M.M. Sch?fer, I. Seuffert, K. T?nsing and D. Anselmetti Single Beam Optical Tweezers Setup with Backscattered Light Detection for Three-Dimensional Measurements on DNA and Nanopores Review of Scientific Instruments, 79, 063702 (2008) Anselmetti, N. Hansmeier, J. Kalinowski, J. Martini, T. Merkle, R. Palmisano, R. Ros, K. Schmied, A. Sischka and K. T?nsing Analysis of Subcellular Surface Structure, Function and Dynamics Analytical and Bioanalytical Chemistry, 387, 83 (2007) Sischka, K. T?nsing, R. Eckel, S.D. Wilking, N. Sewald, R. Ros and D. Anselmetti Molecular Mechanisms and Kinetics between DNA and DNA Binding Ligands Biophysical Journal, 88, 404 (2005) 中國(guó)代理服務(wù)商：北京思睿維科技有限公司 馬金龍
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