【應(yīng)用文章下載】SNP基因分型高通量檢測方法新思路Molecular Devices

時(shí)間：2018-5-11 閱讀：1231

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SNP基因分型高通量檢測方法新思路
單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP），主要指在基因組水平上由單個(gè)核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。它是人類可遺傳的變異中zui常見的一種，占所有已知多態(tài)性的90%以上。SNP在人類基因組中廣泛存在，平均每500～1000個(gè)堿基對(duì)中就有1個(gè)，估計(jì)其總數(shù)可達(dá)300萬個(gè)甚至更多。單核苷酸多態(tài)性是基因組上單個(gè)核苷酸的變異，包括置換、顛換、缺失和插入。近年來，單核苷酸多態(tài)性研究備受關(guān)注。由于個(gè)體間核苷酸序列存在很大差異，SNP的數(shù)量幾乎是無限的，且每個(gè)SNP可能是潛在的有用標(biāo)記。SNP標(biāo)記的潛力已在人類基因分型中得到很好的展示。雖然此技術(shù)廣泛應(yīng)用于人類和動(dòng)物基因組分析，但在植物上仍處于起步階段，目前在水稻、玉米、大豆等作物研究中應(yīng)用較多。研究表明，作物基因組序列均含有豐富的SNP，對(duì)其進(jìn)行SNP研究，有利于揭示作物生長發(fā)育規(guī)律，而新的檢測技術(shù)也促進(jìn)了以SNP 為核心的高通量基因分型技術(shù)的發(fā)展，極大地推動(dòng)了農(nóng)作物在遺傳、種質(zhì)鑒定和功能基因的克隆與鑒定、分子育種等方面的研究。隨著SNP研究的日益增多，相關(guān)的檢測技術(shù)也層出不窮，競爭性等位基因特異性PCR（Kompetitive Allele Specific PCR，KASP）便是其中之一，可在廣泛的基因組DNA 樣品中（甚至是一些復(fù)雜基因組的DNA 樣品），對(duì)SNP和特定位點(diǎn)上的插入、缺失進(jìn)行的雙等位基因判斷，此方法利用2個(gè)熒光探針、2個(gè)通用淬滅探針，再加多個(gè)位點(diǎn)特異探針來檢則多個(gè)SNP位點(diǎn)，原理上類似Taqman檢測，也是基于終端熒光讀取判斷，每孔采用雙色熒光檢測一個(gè)樣本的一個(gè)位點(diǎn)可能的兩種基因型，但與Taqman技術(shù)不同的是，它不需要每個(gè)SNP位點(diǎn)都去合成特異的熒光引物，基于自己的ARM PCR原理，讓所有的位點(diǎn)檢測zui終都使用通用熒光引物擴(kuò)增，大大降低了KASP的試劑成本，比Taqman具有更好的位點(diǎn)適應(yīng)性，所以在醫(yī)學(xué)、農(nóng)學(xué)檢測方面都有非常好的應(yīng)用。 KASP方法的樣品一般可放于多孔板中如*96孔板，非常適合在具有熒光檢測功能的酶標(biāo)儀上進(jìn)行熒光信號(hào)的讀取，以下便是在SpectraMax i3x和SpectraMax M5e酶標(biāo)儀中讀取KASP樣品產(chǎn)生的熒光信號(hào)后所繪制的散點(diǎn)圖：


上左圖：FAM、HEX和兩者的混合物的相對(duì)熒光強(qiáng)度與ROX進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化且標(biāo)準(zhǔn)化值在SoftMax Pro軟件中繪制散點(diǎn)圖。如圖所示，得到了三個(gè)不同的集群。上右圖：ROX標(biāo)準(zhǔn)化的DNA擴(kuò)增樣品熒光在SoftMax Pro軟件中繪制散點(diǎn)圖。三個(gè)顯著的集群被檢測出來。FAM純合子位置靠近X軸，而HEX純合子則位置靠近Y軸，包含F(xiàn)AM和HEX的雜合樣品所形成的的集群在兩個(gè)純合子集群之間。無模板對(duì)照形成的集群靠近坐標(biāo)0點(diǎn)位置。所得數(shù)據(jù)與供應(yīng)商驗(yàn)證試劑盒基因分型結(jié)果高度一致。

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