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使用EVIDENT共聚焦顯微鏡對(duì)血管化腫瘤細(xì)胞球芯片進(jìn)行觀察研究

閱讀:162      發(fā)布時(shí)間:2025-3-7
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研究顯示,腫瘤可通過(guò)誘導(dǎo)血管生長(zhǎng)來(lái)支持其旺盛的活性。這些血管作為腫瘤的生命線,在腫瘤微環(huán)境(TME)中對(duì)于其活性起到了相當(dāng)重要的作用。到目前為止,對(duì)腫瘤在生化和生物力學(xué)刺激的反應(yīng),大多是在靜態(tài)條件下進(jìn)行評(píng)估,并沒有考慮到血流對(duì)腫瘤的影響。本篇文章,我們提供了一個(gè)腫瘤-芯片平臺(tái),通過(guò)流經(jīng)可灌注血管網(wǎng)絡(luò)的介質(zhì)流來(lái)評(píng)估腫瘤微環(huán)境,并測(cè)量血流中的給藥效應(yīng)。


圖片


圖1.微流控設(shè)備和腫瘤模型。(左)微流控設(shè)備圖;(右)具有可灌注血管網(wǎng)絡(luò)的腫瘤模型。


腫瘤細(xì)胞球在微流控設(shè)備中的3D觀察結(jié)果

本研究中,我們?cè)谖⒘骺卦O(shè)備中將人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)與含有人乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)的腫瘤細(xì)胞球進(jìn)行共同培養(yǎng),以重現(xiàn)包括血管網(wǎng)絡(luò)在內(nèi)的腫瘤微環(huán)境。為了確認(rèn)微流控設(shè)備中血管網(wǎng)絡(luò)的可灌注性,我們使用FLUOVIEW共聚焦顯微鏡觀察熒光微球(綠色)是否能夠連續(xù)通過(guò)血管網(wǎng)絡(luò)和球細(xì)胞。因細(xì)胞球較厚,我們很難獲得培養(yǎng)樣本的三維圖像。通常需要較高的激發(fā)光強(qiáng)度才能產(chǎn)生足以能夠檢測(cè)到的熒光信號(hào)強(qiáng)度。
但是,較高的激發(fā)光強(qiáng)度也會(huì)增大光毒性,從而導(dǎo)致細(xì)胞損傷。為了解決這一問(wèn)題,我們使用集成了TruSpectral全真光譜檢測(cè)技術(shù)和高靈敏度GaAsP探測(cè)器的FLUOVIEW共聚焦顯微鏡,捕獲微弱的熒光信號(hào),同時(shí)盡量降低激光器的功率。


圖片

圖2.腫瘤細(xì)胞球及其血管網(wǎng)絡(luò)。細(xì)胞核:青色(405 nm,Hoechst 33342),RFP-HUVEC:紫紅色(561 nm,RFP),E-鈣粘蛋白:黃色(640 nm,Alexa Fluor 633)。


(a) 腫瘤細(xì)胞球的投影圖。比例尺:200 μm,物鏡:UPLSAPO10X2。(b)(a)中白色框架的3平面圖像(x-y、x-z、y-z)。比例尺:20 μm,物鏡:UPLSAPO40X2。

使用共振掃描振鏡進(jìn)行血流快速成像

我們還利用熒光微球(綠色,直徑3.1 μm)檢查了腫瘤細(xì)胞球血管網(wǎng)絡(luò)內(nèi)的血流。在觀察快速血流時(shí),常規(guī)掃描振鏡的掃描速度可能不夠。本實(shí)驗(yàn)中,我們使用配有高速共振掃描振鏡的FLUOVIEW共聚焦顯微鏡采集圖像。
結(jié)果表明,在將熒光微球注入到微流控設(shè)備的通道3時(shí),微球流經(jīng)腫瘤細(xì)胞球的中空腔并到達(dá)通道1,說(shuō)明我們所設(shè)計(jì)的血管網(wǎng)絡(luò)可接受灌注。確認(rèn)人工腫瘤細(xì)胞球模型用于研究血流對(duì)TME影響的有效性后,我們?cè)陔S后的實(shí)驗(yàn)中明確了,在包括血管網(wǎng)絡(luò)的TME中,藥物的療效因血管內(nèi)是否存在血流而異。我們希望這款三維模型能夠在今后被用作經(jīng)血管給藥模型,以協(xié)助藥物的開發(fā)。


視頻:微流控設(shè)備上人造血管和腫瘤細(xì)胞球內(nèi)熒光微球的流動(dòng)。成像條件:65 毫秒/幀。比例尺:100 μm。



這項(xiàng)研究的新穎之處在于,在腫瘤細(xì)胞球內(nèi),人工構(gòu)建的可灌注血管網(wǎng)絡(luò)??梢暬芫W(wǎng)絡(luò)如何連接細(xì)胞球和微流控通道非常重要。此外,可以同時(shí)觀察血管管腔和流經(jīng)血管結(jié)構(gòu)的血流,對(duì)于證明其可灌注性來(lái)說(shuō)也很關(guān)鍵。FLUOVIEW共聚焦顯微鏡上安裝的高速共振掃描振鏡,能夠?qū)ρ芫W(wǎng)絡(luò)(RFP標(biāo)記)和微球(綠色)動(dòng)態(tài)流進(jìn)行成像。


——Ryuji Yokokawa博士

日本京都大學(xué)微工程系



腫瘤學(xué)研究和藥物研發(fā)對(duì)顯微成像的要求非常高,需要有高速的三維成像能力,在體的研究還需要低光度性的深層成像,Evident全新激光掃描共聚焦顯微鏡和多光子顯微鏡FV4000(MPE)配備全新的高靈敏硅基半導(dǎo)體檢測(cè)器,具有更高的靈敏度,降低了光毒性,同時(shí)高分辨率的共振掃描振鏡可提供視頻級(jí)采集速率,幫助獲取腫瘤微環(huán)境或藥物代謝的動(dòng)態(tài)變化過(guò)程。

圖片

左圖:FV4000激光掃描共聚焦顯微鏡;右圖:FV4000MPE多光子顯微鏡



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