產(chǎn)品英文名：TAKARA RetroNectin®(Recombinant Human Fibronectin Fragment)，F(xiàn)N CH-296

產(chǎn)品中文名：TAKARA RetroNectin®重組人纖維蛋白片段，F(xiàn)N CH-296

RetroNectin® 重組人纖維蛋白片段

RetroNectin^®是在大腸桿菌中產(chǎn)生的重組人纖維蛋白片段FN CH-296。 當(dāng)包被在培養(yǎng)瓶和培養(yǎng)板表面時，RetroNectin^®能顯著增強逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移到哺乳動物細胞中。

RetroNectin^®重組人纖維蛋白片段和激發(fā)型CD3單抗可分別與T淋巴細胞上的VLA和TCR結(jié)合，兩者共同作用激活酪氨酸激酶pp125FAK，通過Ras途徑刺激T細胞的增殖和分化，使其獲得上千倍的增殖。

組份

RetroNectin (Recombinant Human Fibronectin Fragment)  0.5 mg (Cat. #T100A)

RetroNectin (Recombinant Human Fibronectin Fragment)  2.5 mg (Cat. #T100B)

RetroNectin is provided as a sterile 1 mg/ml solution.

[Form]　Sterile solution containing 12.5 mM sodium citrate (pH 6.2) and 1.25% sucrose

儲存

-20℃

Caution:  Freezing and thawing can be repeated up to 10 times

*：

訂購RetroNectin歡迎您咨詢華雅再生醫(yī)學(xué)旗艦公司：紅榮微再（上海）生物工程技術(shù)有限公司 。紅榮微再*代理TAKARA CellArtis ，Rubicon產(chǎn)品。紅榮微再（上海）生物工程技術(shù)有限公司以“傳遞科學(xué)價值，服務(wù)科學(xué)研究”為宗旨，主營干細胞、精準(zhǔn)醫(yī)療、細胞治療、器官再生四大板塊的產(chǎn)品。

RetroNectin原理

RetroNectin是重組人纖維蛋白片段FN CH-296，包括細胞結(jié)合域，肝磷脂結(jié)合域和CS1位點三個功能區(qū)域。它由574個氨基酸組成，分子量63 kDa。RetroNectin能夠大幅地提高逆轉(zhuǎn)錄病毒感染哺乳動物細胞的感染效率，其作用原理是：細胞表面VLA-4及VLA-5可分別與RetroNectin上的CS-1位點及細胞結(jié)合域結(jié)合，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可以與肝磷脂結(jié)合域結(jié)合。在經(jīng)RetroNectin包被的培養(yǎng)容器表面，細胞與病毒載體以高濃度共存，從而提高基因轉(zhuǎn)染效率。RetroNectin^®重組人纖維蛋白片段和激發(fā)型CD3單抗可分別與T淋巴細胞上的VLA和TCR結(jié)合，兩者共同作用激活酪氨酸激酶pp125FAK，通過Ras途徑刺激T細胞的增殖和分化，使其獲得上千倍的增殖。

RetroNectin逆轉(zhuǎn)錄技術(shù)操作流程

RetroNectin技術(shù)可以顯著提高逆轉(zhuǎn)錄病毒的轉(zhuǎn)染效率，這一發(fā)現(xiàn)克服了向造血干細胞中導(dǎo)入基因的困難?，F(xiàn)在，RetroNectin技術(shù)已成為使用逆轉(zhuǎn)錄病毒進行轉(zhuǎn)染操作的常規(guī)選擇，其操作流程大致如下：

1. 注射用水或滅菌蒸餾水充分溶解RetroNectin，調(diào)節(jié)濃度至1mg/ml。

2. 0.22 μm濾膜過濾RetroNectin溶液，分裝后-20 ℃保存。

3. 用緩沖液將RetroNectin溶液稀釋至20～100 μg/ml。

4. 將RetroNectin稀釋液加入24孔板，每孔0.5 ml (建議用PBS緩沖液稀釋RetroNectin后包被Non-Tissue Cluture Treated plate。

5. 室溫放置4小時或4 ℃，避光，過夜。

6. 吸出RetroNectin溶液，每孔加入PBS終止液0.5 ml。

7. 室溫放置30分鐘。

8. 加入適量PBS清洗孔板。

9. 吸出清洗液，得到RetroNectin包被的孔板 (如果暫不使用，可以在孔中加入適量PBS，用膠膜將平板蓋密封，避免RetroNectin干燥，可于4 ℃保存4周。使用前將PBS吸出) 。

10. 逆轉(zhuǎn)錄病毒保存液 (-80 ℃) 于37 ℃水浴融解。

11. 將病毒液加入包被后的24孔板，每孔300 μl。

12. 32 ℃放置4小時。

13. 吸出病毒保存液。

14. 每孔加入待轉(zhuǎn)染的細胞懸液400 μl (通常細胞濃度為1 × 105/ml) 。

RetroNectin增強T細胞擴增技術(shù)流程

T-cell expansion protocol using RetroNectin reagent, GT-T551 T-cell medium, CultiLife bags, and anti-CD3 mAb.

1.  RetroNectin和CD3單克隆抗體包被培養(yǎng)袋。

2.  同時，來自PBMC的T細胞用GT-T551培養(yǎng)基+IL-2+血漿培養(yǎng)。

3.  第4天，T細胞轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)袋，繼續(xù)用GT-T551培養(yǎng)基+IL-2+血漿培養(yǎng)。

4.  第7天，添加更多GT-T551培養(yǎng)基+IL-2。

5.  第10天，分裝兩個培養(yǎng)袋，添加更多GT-T551培養(yǎng)基+IL-2。

PBMCs and autologous plasma were prepared using 50 ml of blood from two healthy volunteers with informed consent. PBMCs from each donor were split into two samples to test anti-CD3-antibody- and IL-2-induced expansion with or without RetroNectin reagent (RN). CultiLife 215 bags (CultiLife 215 Culture Bag, Cat. No. FU0005) were coated with either anti-CD3 antibody plus RN or anti-CD3 antibody alone in PBS for 2 hr, then rinsed three times with PBS. On Day 0, PBMCs were resuspended in 50 ml of GT-T551 medium supplemented with heat-inactivated plasma (0.6% final volume) and added to the coated CultiLife 215 bags. Additional GT-T551 medium supplemented with IL-2 and plasma was added to each CultiLife 215 bag to reach a final volume of 250 ml. The PBMCs were transferred to CultiLife Eva bags (GT-T610 [CultiLife Eva] Culture Bag, Cat. No. FU0010) on Day 4 and fresh GT-T551 medium (with IL-2 and 0.6% inactivated plasma) was added to bring the volume to 500 ml per bag. An additional 500 ml of medium supplemented with only IL-2 was added on Day 7. On Day 10, cells were split into two CultiLife Eva bags, with fresh medium and IL-2 added to bring the final volume of each bag to 1,000 ml. The cells were harvested on Day 14, the total number of T cells was counted, and the proportion of naïve (CD45RA+/CCR7+) T cells was determined by flow cytometry analysis.

PBMC：人外周血單個核細胞

參考文獻

1)  Kimizuka F,et al.Production and characterization of functional domains of human

fibronectin expressed inEscherichia coli. J Biochem. (1991) 110: 284-291.

2)  Hanenberg H, et al. Colocalization of retrovirus and target cells on specific fibronectin fragments increases genetic transduction of mammalian cells.Nat Med. (1996) 2: 876-882.

3)  Hanenberg H, et al. Optimization of fibronectin-assisted retroviral gene transfer into human CD34+ hematopoietic cells.Hum Gene Ther. (1997) 8: 2193-2206.

4)  Pollok KE,et al.High-efficiency gene transfer into normal and adenosine deaminase-deficient T lymphocytes is mediated by transduction on recombinant fibronectin fragments.J Virol. (1998) 72: 4882-4892.

5)  Chono H, et al. Removal of inhibitory substance with recombinant fibronectin-CH-296 plates enhances the retroviral transduction efficiency of CD34+CD38- bone marrow cells.J Biochem. (2001) 130: 331-334.

6）  Barbara Savoldo,et al.CD28 costimulation improves expansion and persistence of chimeric antigen receptor–modified T cells in lymphoma patients.J Clin Invest.( 2011) May 2; 121(5): 1822–1826.

[1]張慧穎. RetroNectin活化的細胞因子誘導(dǎo)的殺傷細胞治療晚期原發(fā)性肝癌的臨床研究[D].鄭州大學(xué),2014.

[2]蔣盼,曠世佳,劉興光,肖棟濤,楊菁,張雁,汪華.冷凍聯(lián)合iCIK細胞治療口腔惡性黑色素瘤的T細胞免疫效應(yīng)分析[J].中華臨床醫(yī)師雜志(電子版),2013,7(11):4944-4949.

[3]徐本玲,袁龍,高全立,范瑞華,張成娟,宋永平.重組纖維連接蛋白誘導(dǎo)自體CIK聯(lián)合IFN-α治療晚期肝癌療效[J].鄭州大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版),2011,46(05):694-696.

[4]張興華. 剔除調(diào)節(jié)性T細胞增強RAK過繼免疫治療機制的研究[D].北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院,2011.

[5]張興華,袁偉,趙晨,馬潔,趙平.R etronectin和CD3mAb聯(lián)合培養(yǎng)CD56~+細胞用于治療胰腺癌的研究[J].實用腫瘤雜志,2011,26(02):113-118.

[6]韓穎,于津浦,李慧,曹水,任寶柱,齊靜,安秀梅,張廼寧,任秀寶,郝希山.重組人纖維蛋白片段對CIK細胞增殖的影響及其可能機制研究[J].中國腫瘤臨床,2010,37(02):71-75.

[7]杜微麗. 纖維連接蛋白誘導(dǎo)的CIK細胞的生物學(xué)特性和殺瘤活性的實驗研究[D].中國醫(yī)科大學(xué),2009.

[8]任瑋,王志華.重組人纖維蛋白片段誘導(dǎo)CIK的增殖及對肺癌耐順鉑細胞的殺傷作用[J].生物工程學(xué)報,2008(08):1373-1380.

[9]楊建民,Michael S Friedman,李嶠,James J Mule,Alfred E Chang,Kevin T McDonagh.轉(zhuǎn)染嵌合性T細胞受體基因小鼠T淋巴細胞的體外抗腫瘤作用[J].中國腫瘤生物治療雜志,2006(04):243-248.

文獻簡述

Retronectin重組人纖維蛋白除了提高逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)染效率，還能在CD3單克隆抗體的協(xié)作下，刺激T細胞、CIK細胞和RAK細胞等的擴增。

Information: T-cell expansion by RetroNectin stimulation RetroNectin reagent has been widely used to enhance retroviral and lentiviral gene transfer into mammalian cells.

In addition, RetroNectin reagent enhances the proliferation of T lymphocytes. T cells are conventionally expanded in the presence of Interleukin-2 (IL-2) by stimulation with anti-CD3 antibody. The addition of RetroNectin in this stimulation step dramatically increases the efficiency of T cell expansion. In addition, T cells expanded with this method contain a high proportion of less-differentiated T cells (naive T cells). Naive T cells have the ability to differentiate into cytotoxic T cells in vivo.

[1] 張慧穎. RetroNectin活化的細胞因子誘導(dǎo)的殺傷細胞治療晚期原發(fā)性肝癌的臨床研究[D].鄭州大學(xué),2014.

研究發(fā)現(xiàn)，重組人纖維蛋白（RetroNectin-RN）聯(lián)合抗CD3單克隆抗體體外包被培養(yǎng)和擴增CIK細胞時可以使CD3Ab與T細胞的接觸和黏附進一步增加，不僅可以縮短細胞培養(yǎng)時間，而且可進一步提高細胞的培養(yǎng)效率并避免CIK細胞殺傷活性的降低。

關(guān)鍵詞：晚期原發(fā)性肝癌; RetroNectin; CIK; 臨床研究;

[2] 任瑋,王志華.重組人纖維蛋白片段誘導(dǎo)CIK的增殖及對肺癌耐順鉑細胞的殺傷作用[J].生物工程學(xué)報,2008(08):1373-1380.

Retronectin重組人纖維蛋白對CIK細胞有很強的激活作用,可使其細胞增殖總數(shù)達524.77倍,其主要效應(yīng)細胞CD3+CD56+可達(31.40±1.91)%;對肺癌耐順鉑細胞DDP-A549的殺傷作用明顯高于其親代藥物敏感株A549(P<0.01)。但兩組CIK細胞對靶細胞的殺傷率在相同效靶比時無明顯差異(P>0.05)。RetroNectin能顯著增強CIK增殖活性,但對CIK細胞的殺傷活性并無明顯影響。CIK能夠顯著抑制DDP-A549的生長,可用于耐順鉑肺腺癌的免疫治療。

關(guān)鍵詞：細胞因子誘導(dǎo)的殺傷細胞; RetroNectin; 增殖; 肺癌細胞; 殺傷活性;

[3] 韓穎,于津浦,李慧,曹水,任寶柱,齊靜,安秀梅,張廼寧,任秀寶,郝希山.重組人纖維蛋白片段對CIK細胞增殖的影響及其可能機制研究[J].中國腫瘤臨床,2010,37(02):71-75.

重組人纖維蛋白片段（RetroNectin）能夠通過調(diào)控細胞周期,抵抗凋亡而促進CIK細胞增殖,其機制可能為RetroNectin與CIK細胞上VLA-4及VLA-5兩個位點結(jié)合進而通過Vav1蛋白作為第二信號活化T細胞。

關(guān)鍵詞：重組人纖維蛋白片段; CIK細胞; Vavl;

[4] 張興華. 剔除調(diào)節(jié)性T細胞增強RAK過繼免疫治療機制的研究[D].北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院,2011.

Retronectin重組人纖維蛋白和CD3mAb聯(lián)用所培養(yǎng)獲得RAK細胞具有較強的增殖能力,培養(yǎng)后細胞表型絕大多數(shù)是CD3+CD8+T細胞。在RAK細胞培養(yǎng)前加以調(diào)節(jié)性T細胞剔除的步驟,能夠在此基礎(chǔ)上進一步放大細胞增殖和殺傷能力。

關(guān)鍵詞：調(diào)節(jié)性T細胞; 過繼免疫治療; Retronectin;

[5] 張興華,袁偉,趙晨,馬潔,趙平.R etronectin和CD3mAb聯(lián)合培養(yǎng)CD56~+細胞用于治療胰腺癌的研究[J].實用腫瘤雜志,2011,26(02):113-118.

CD3mAb和Retronectin重組人纖維蛋白聯(lián)合培養(yǎng)CD56+細胞的方法能夠提高細胞的增殖效率和殺傷活性,具有良好的臨床細胞治療應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞：胰腺腫瘤/治療; 殺傷細胞,天然; 免疫療法,過繼; 細胞,培養(yǎng)的; 重組融合蛋白質(zhì)類; 單核細胞/免疫學(xué);

[6] 尹健. 外周造血干細胞純化、體外擴增及多藥耐藥基因轉(zhuǎn)染的實驗研究[D].天津醫(yī)科大學(xué),2003.

利用逆轉(zhuǎn)錄病毒作載體將多藥耐藥基因?qū)朐煅杉毎?，在轉(zhuǎn)染中予細胞因子支持，并利用Retronectin重組人纖維蛋白以提高轉(zhuǎn)染效率。在SCF+IL一3+FL+TPO+EPO的支持下，利用Retronectin重組人纖維蛋白可以使逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的多藥耐藥基因的轉(zhuǎn)染效率達到20%，基本滿足了臨床治療的需要。

關(guān)鍵詞：外周造血干細胞; 純化; 擴增; 多藥耐藥基因;

[7] 楊建民,Michael S Friedman,李嶠,James J Mule,Alfred E Chang,Kevin T McDonagh.轉(zhuǎn)染嵌合性T細胞受體基因小鼠T淋巴細胞的體外抗腫瘤作用[J].中國腫瘤生物治療雜志,2006(04):243-248.

Retronectin重組人纖維蛋白結(jié)合離心法轉(zhuǎn)染經(jīng)抗CD3/CD28單抗活化的小鼠T淋巴細胞,轉(zhuǎn)染效率可達50%以上。轉(zhuǎn)染嵌合性T細胞受體基因的小鼠T淋巴細胞在體外可通過細胞因子釋放和CTL效應(yīng)發(fā)揮顯著的抗腫瘤作用。

關(guān)鍵詞：嵌合性T細胞受體; 基因轉(zhuǎn)染; 免疫治療; 小鼠; T淋巴細胞;

推薦產(chǎn)品

更多TAKARA產(chǎn)品及免疫細胞治療產(chǎn)品華雅再生醫(yī)學(xué)旗艦公司：紅榮微再（上海）生物工程技術(shù)有限公司  ：1500 1904 520。紅榮微再-客服: 2395557778  經(jīng)銷商專員