您好, 歡迎來到化工儀器網(wǎng)
產(chǎn)品分類品牌分類
-
混勻儀|混合器 氣體發(fā)生器 分光測色計 勻漿機(jī) 研磨機(jī) 超凈工作臺 洗板機(jī) 高低溫試驗箱 恒溫金屬浴 電阻爐 溶劑過濾器 漩渦混合儀|旋渦混勻儀 均質(zhì)器 水槽 恒溫水槽 手套 培養(yǎng)板 生物安全柜 天平 滴定管 瓶口分液器 光澤儀 錐入度儀 濁度計 分析儀 冷藏保存箱 色差儀 超純水機(jī) 預(yù)制冷槽 油浴槽 冷卻水循環(huán)裝置 溶媒回收裝置 恒溫水浴槽 液氮罐 馬弗爐 酶標(biāo)儀 培養(yǎng)箱 電泳儀 潔凈工作臺 干燥箱 磁力攪拌器 滅菌器 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 低溫冰箱 防爆冰箱 離心機(jī) 振蕩器 移液器 真空泵
PCR的基本原理
1概述
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase chain reaction，縮寫：PCR，又稱多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))，是一項利用DNA雙鏈復(fù)制的原理，在生物體外復(fù)制特定DNA片段的核酸合成技術(shù)。透過這項技術(shù)，可在短時間內(nèi)大量擴(kuò)增目的基因，而不必依賴大腸桿菌或酵母菌等生物體。
2 PCR原理
PCR技術(shù)的基本原理首先基于DNA半保留復(fù)制原理，還有堿基互補(bǔ)配對原則，即復(fù)制的過程中雙鏈DNA會解鏈，由雙鏈變成單鏈，溫度一般為95℃；之后溫度降下來，引物會結(jié)合到DNA單鏈上，在DNA聚合酶的作用下，把游離的dNTP按照堿基互補(bǔ)配對原則結(jié)合到單鏈上，形成一條由舊鏈和新鏈雜合成的新的雙鏈DNA。這個過程可概括為‘變性-退火-延伸’三個基本步驟。
一般的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)由20到35個循環(huán)組成，每個循環(huán)包括以下3個步驟：
變性：利用高溫（94℃～98℃）使雙鏈DNA分離。高溫將連接兩條DNA鏈的氫鍵打斷。在第一個循環(huán)之前，通常加熱長一些時間以確保模板和引物全分離，僅以單鏈形式存在。該步驟時間1～2分鐘，接下來機(jī)器就控制溫度進(jìn)入循環(huán)階段。
退火（又稱復(fù)性、降溫貼合、緩冷配對、引物黏合）：在DNA雙鏈分離后，降低溫度使得引物可以結(jié)合于單鏈DNA上。此階段的溫度通常低于引物熔點5℃。錯誤的退火溫度可能導(dǎo)致引物不與模板結(jié)合或者錯誤地結(jié)合。該步驟時間1～2分鐘。新技術(shù)的融合型核酸聚合酶在此階段的溫度會高于熔點3~5℃，僅需時間5~10秒。
延伸：DNA聚合酶由降溫時結(jié)合上的引物開始沿著DNA鏈合成互補(bǔ)鏈。此階段的溫度依賴于DNA聚合酶。該步驟時間依賴于聚合酶以及需要合成的DNA片段長度。傳統(tǒng)的Taq估計合成1000 bp大概需要1分鐘、較新的Tbr（來自于嗜熱菌Thermus brockianus）約40秒、商業(yè)公司生產(chǎn)的融合型聚合酶僅需約10-15秒。有修正功能的則會比較慢。
3 PCR反應(yīng)體系表1 標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系
| 組分 | 用量 |
| 10×擴(kuò)增緩沖液 | 10μl |
| 4種dNTP混合物 | 200μl |
| 引物 | 10～100μl |
| 模板DNA | 0.1～2μg |
| Taq DNA聚合酶 | 2.5 μl |
| Mg2+ | 1.5mmol/L |
| 加雙蒸水 | 100 μl |
4 PCR反應(yīng)特點
4.1特異性強(qiáng)
PCR反應(yīng)的特異性決定因素為：
①引物與模板DNA特異正確的結(jié)合；
②堿基配對原則；
③Taq DNA聚合酶合成反應(yīng)的忠實性；
④靶基因的特異性與保守性。
4.2 靈敏度高
PCR產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式增加的，能將皮克(pg=10-12)量級的起始待測模板擴(kuò)增到微克(μg=10-6)水平。能從100萬個細(xì)胞中檢出一個靶細(xì)胞；在病毒的檢測中，PCR的靈敏度可達(dá)3個RFU(空斑形成單位)；在細(xì)菌學(xué)中最小檢出率為3個細(xì)菌。
4.3簡便、快速
PCR反應(yīng)用耐高溫的Taq DNA聚合酶，一次性地將反應(yīng)液加好后，經(jīng)過變性-退火-延伸反應(yīng)，一般在2～4 小時完成擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增產(chǎn)物一般用電泳分析，不一定要用同位素，無放射性污染、易推廣。
4.4 對標(biāo)本的純度要求低
不需要分離病毒或細(xì)菌及培養(yǎng)細(xì)胞，DNA粗制品及RNA均可作為擴(kuò)增模板?？芍苯佑门R床標(biāo)本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活組織等DNA擴(kuò)增檢測。