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   間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基是 為擴(kuò)增從骨髓、臍帶血或脂肪組織提取的人類間充質(zhì)干細(xì)胞（human mesenchymalstem cells, hMSC）而設(shè)計(jì)的無血清培養(yǎng)基。該人間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基化學(xué)成分明確，所有組分為化學(xué)合成或重組純化的蛋白，并且無異源蛋白，不含直接從任何動物組織提取成份。因此它不存在批間誤差和潛在的動物源性病原體。如果配合使用特定的培養(yǎng)板（見下），還可以省去鋪板的工序和時(shí)間，免去鋪板膠的費(fèi)用。

一 人間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基配制：

1. 2‐8℃解凍添加物。

2. 無菌條件下配制100ml間充質(zhì)干細(xì)胞無血清*培養(yǎng)基。

3.如果需要也可加入抗菌素（自選）。

配制好的間充質(zhì)干細(xì)胞無血清*培養(yǎng)液（包含基礎(chǔ)培養(yǎng)基、添加物、谷氨酸鹽）2-8℃ 避光保存，保存期1 個(gè)月。

二 培養(yǎng)基的使用：

培養(yǎng)于其它無血清或有血清培養(yǎng)基的MSCs 可以快捷方便地轉(zhuǎn)換到本品中培養(yǎng)。多數(shù)情況下，生長狀態(tài)良好的MSCs直接換液為本品即可。個(gè)別情況下，可能需要逐步轉(zhuǎn)換，如按20%，40%，60%，80%，100%依次遞增，至zui終*使用本品。

三 StemRD hMSCs細(xì)胞的復(fù)蘇：

1.37℃水浴快速復(fù)蘇凍融細(xì)胞。

2.將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到無菌50ml離心管中。

3.逐滴向裝有1ml細(xì)胞液的離心管中加入10ml預(yù)先復(fù)溫的間充質(zhì)干細(xì)胞無血清*培養(yǎng)基，注意邊加邊輕輕晃動離心管。

4.將上述混合溶液轉(zhuǎn)移到細(xì)胞培養(yǎng)瓶或細(xì)胞培養(yǎng)板中。

5.在5%CO2，37℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。

6.培養(yǎng)24h，換液。

7.此后每隔2天換液，直到傳代培養(yǎng)。

四 StemRD人間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)：

如果使用特定的細(xì)胞培養(yǎng)板，如BD PrimariaTM 系列產(chǎn)品或Corning CellBINDTM 系列產(chǎn)品，那么使用本產(chǎn)品培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞是不需要預(yù)先鋪板。傳統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)瓶和培養(yǎng)板是否無需鋪板正在評估中。對于那些還沒有被評估的產(chǎn)品或不適用于不預(yù)先鋪板工序的產(chǎn)品，推薦使用人纖維連接蛋白（Fibronectin）進(jìn)行鋪板。

1.在鏡下觀察（使用本產(chǎn)品或其它培養(yǎng)基）細(xì)胞，確定傳代的時(shí)間，推薦在細(xì)胞量達(dá)到70%滿的時(shí)候傳代，不要讓細(xì)胞超過80%滿！

2.預(yù)先將0.05%胰酶/0.53mM EDTA和間充質(zhì)干細(xì)胞無血清*培養(yǎng)基復(fù)溫到37℃待用。

3.用移液槍吸走舊培養(yǎng)基。

4.用DPBS洗一遍（自選）。

5.加入0.05%胰酶/0.53mM EDTA液以覆蓋住細(xì)胞表面，推薦室溫消化細(xì)胞（消化液用量：6孔板每孔約10cm2加入0.5ml，25cm2培養(yǎng)板加入1ml）。

6. 鏡下觀察細(xì)胞，當(dāng)看見細(xì)胞開始從培養(yǎng)板底脫離，輕輕敲擊培養(yǎng)板邊緣幫助細(xì)胞脫落。消化時(shí)間為1‐3分鐘。

7. 加入2倍于消化液體積的間充質(zhì)干細(xì)胞無血清*培養(yǎng)基，將細(xì)胞懸液收集于15ml離心管中。

8.1200rpm離心10分鐘。

9.盡量棄去離心后的上層清液。用間充質(zhì)干細(xì)胞無血清*培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。此時(shí)可取細(xì)胞懸液進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

10.按照3-5X103/cm2密度接種細(xì)胞。

11.5%CO2，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

12.每隔2天換新鮮的間充質(zhì)干細(xì)胞無血清*培養(yǎng)基。

13.當(dāng)細(xì)胞生長達(dá)到70%滿時(shí)，傳代（一般每隔3-4天）。

五 凍存細(xì)胞：

1.配制細(xì)胞凍存液。

2.離心分離細(xì)胞，用凍存液重懸細(xì)胞。

3.將凍存管轉(zhuǎn)移到凍存盒中，置于-80℃冰箱。

4.將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到液氮罐中長期貯存。