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做透Octet，發(fā)Nature！看看教科書級(jí)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
如何評(píng)價(jià)一篇好文章？創(chuàng)新性和可信性才是關(guān)鍵標(biāo)準(zhǔn)，而非所用技術(shù)手段的復(fù)雜程度。近期，《Nature》發(fā)表的一篇文章，僅僅采用了兩種主要技術(shù)手段便一氣呵成。今天，就讓陳老師帶大家一探究竟。
人類免疫缺陷病毒（HIV）的感染是導(dǎo)致艾滋病的原因，HIV要實(shí)現(xiàn)復(fù)制和傳播，需要將遺傳物質(zhì)傳遞到細(xì)胞核內(nèi)并整合進(jìn)染色體中。近日，馬克斯-普朗克研究所與麻省理工學(xué)院合作發(fā)表的一篇《Nature》文章[1]，揭示了HIV是如何進(jìn)入核孔的。研究首先指向了核孔復(fù)合物（NPC），它由約30種不同的核孔蛋白（Nup）構(gòu)建而成，其中包括約10種所謂的FG-Nup，它們將形成屏障的苯丙氨酸-甘氨酸（FG）重復(fù)結(jié)構(gòu)域錨定到NPC支架上，呈凝膠狀，被稱為FG相（FG phase）。這種FG相填充在核孔中，通常只允許核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（NTR）通過，然而研究發(fā)現(xiàn)，HIV衣殼也可以滑過核孔的FG相。
圖1. NTR和HIV通過NPC示意圖
這篇發(fā)表在《Nature》雜志的文章所用的技術(shù)手段非常簡(jiǎn)單，主要通過激光共聚焦對(duì)核膜與HIV進(jìn)行共定位，并利用Octet®非標(biāo)記分子互作分析系統(tǒng)檢測(cè)HIV衣殼蛋白CA和核孔蛋白（Nups）之間的分子相互作用。這兩種技術(shù)一表型功能，一內(nèi)在機(jī)制，二者相輔相成。特別是Octet®系統(tǒng)的分子互作數(shù)據(jù)，占據(jù)了文章相當(dāng)?shù)钠?/p>
該文中關(guān)于Octet®分子互作的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案堪稱教科書級(jí)別，值得我們一同細(xì)細(xì)品味：
在Octet®實(shí)驗(yàn)方法中，研究者們將來自五種不同Nups（Nup98、62、58、50和358）的八個(gè)FG結(jié)構(gòu)域固定在鏈霉親和素傳感器上，將二硫鍵穩(wěn)定的CA六聚體作為分析物。
圖2.Octet®實(shí)驗(yàn)方法示意圖
驗(yàn)證Octet®實(shí)驗(yàn)可行性之1
分析物陽(yáng)參對(duì)照設(shè)置
importin β超家族的成員是最大的核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（NTR） 類，允許NTR及其貨物復(fù)合物以非常高的分配系數(shù)進(jìn)入核膜，所以原則上NTR是與FG Nup結(jié)合的理想陽(yáng)性對(duì)照。
圖3. Octet®結(jié)果顯示：分析物importin β可以和含有FG結(jié)構(gòu)域的Nup結(jié)合，其親和力類似
驗(yàn)證Octet®實(shí)驗(yàn)可行性之2
固化物陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照設(shè)置
據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，CA可以和Nup153和CPSF6結(jié)合，所以Nup153和CPSF6可以成為良好的固化物的陽(yáng)性對(duì)照。當(dāng)然，與無關(guān)的固化物陰性對(duì)照Nesprin2沒有結(jié)合。
圖4. 左圖：固化物Nup153與分析物CA六聚體的結(jié)合
中圖：固化物CPSF6與分析物CA六聚體的結(jié)合
右圖：固化物Nesprin2與分析物CA六聚體的結(jié)合
可行性確認(rèn)后，驗(yàn)證CA六聚體與不同Nups的結(jié)合強(qiáng)弱及狀態(tài)。
CA六聚體可以與富含F(xiàn)G結(jié)構(gòu)域的不同家族Nups快速動(dòng)態(tài)結(jié)合，并且與分析物陽(yáng)性對(duì)照Nup153和CPSF6親和力相似，也與importin β親和力相似。因此，CA六聚體可以廣泛的與FG重復(fù)序列的Nups結(jié)合。
圖5. CA六聚體與所有富含F(xiàn)G結(jié)構(gòu)域的Nups結(jié)合，并且結(jié)合速率較快
結(jié)合特異性驗(yàn)證（分析物陰性對(duì)照）
Octet®檢測(cè)發(fā)現(xiàn)FG結(jié)構(gòu)域的Nups與CA-N57A突變（該突變會(huì)阻礙與Nup153和CPSF6的FG基序的相互作用）的親和力減弱。
圖6. 黑色虛線是突變體CA-N57A的親和力，與未突變相比，親和力大大降低。
基于生物層干涉技術(shù)的Octet®非標(biāo)記分子互作系統(tǒng)是這篇《Nature》文章揭示分子機(jī)理的關(guān)鍵方法。一方面，因?yàn)樵诠袒锖头治鑫锷细鞣N對(duì)照讓結(jié)果更可信外，另一方面還因?yàn)镺ctet®系統(tǒng)具有以下優(yōu)點(diǎn)：
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非標(biāo)記Direct binding是趨勢(shì)，結(jié)果更準(zhǔn)確
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快速測(cè)定親和力，更加定量化地表征分子互作
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無洗滌步驟，可測(cè)弱親和力（解離快）；本文的分子互作的解離都比較快，用傳統(tǒng)的pull-down技術(shù)可能會(huì)被洗掉，導(dǎo)致假陰性結(jié)果
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寫入了美國(guó)藥典，文章多，認(rèn)可度廣
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萬(wàn)金油技術(shù)，可以用與檢測(cè)DNA，小分子，蛋白質(zhì)等各種生物分子
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操作簡(jiǎn)便，耗材及維護(hù)成本低
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-參考文獻(xiàn)-
[1] HIV-1 capsids enter the FG phase of nuclear pores like a transport receptor.Nature,2024