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雙抗體夾心法檢測抗原的操作步驟及靈敏度提高方法
閱讀：261 發(fā)布時間：2024-12-17雙抗體夾心法檢測抗原的操作步驟：
1、包被抗體：將特異性抗體（捕獲抗體）包被在固相載體（如酶標板）表面，通常在 4℃ 過夜，使抗體通過物理吸附固定在固相表面。
2、封閉：用封閉液（如 1% - 5% 的牛血清白蛋白溶液）封閉固相載體表面未被抗體占據(jù)的位點，以減少后續(xù)檢測中的非特異性結合。在 37℃ 孵育 1 - 2 小時。
3、加樣：將待測樣品加入到已包被和封閉好的固相載體孔中，在 37℃ 孵育一定時間，使樣品中的抗原與固相載體上的捕獲抗體結合。
4、洗滌：用洗滌液洗去未結合的物質，重復多次以確保洗干凈。
5、加檢測抗體（酶標抗體）：加入酶標記的特異性抗體（檢測抗體），該抗體能識別結合在捕獲抗體上的抗原的另一個表位。在 37℃ 孵育一定時間，使檢測抗體與抗原結合，形成“捕獲抗體 - 抗原 - 酶標檢測抗體"復合物。
6、洗滌：再次用洗滌液洗去未結合的酶標檢測抗體。
7、顯色：加入酶的底物溶液，孵育一段時間，酶催化底物產(chǎn)生顯色反應。
8、終止反應：加入終止液終止顯色反應。
9、結果測定：使用酶標儀在特定波長下測定各孔的吸光度值。根據(jù)標準曲線計算出樣品中抗原的含量。
需要注意的是，實際操作中應根據(jù)具體的試劑盒說明書進行優(yōu)化和調整。
提高雙抗體夾心法的檢測靈敏度方法：
1、優(yōu)化抗體：選擇親和力高、特異性強的優(yōu)質抗體，以增強對抗原的結合能力。
2、增加抗體的包被量：在固相載體上包被更多的捕獲抗體，有助于捕獲更多的抗原。
3、改進包被條件：如優(yōu)化包被緩沖液的 pH 值、離子強度等，以提高抗體與固相載體的結合效率和穩(wěn)定性。
4、延長孵育時間：使抗原與抗體有更充分的結合機會。
5、提高酶的標記效率：使用更高效的標記方法或選擇活性更高的酶標記檢測抗體，以增強顯色信號。
6、優(yōu)化顯色系統(tǒng)：選擇更靈敏的顯色底物，或者改進顯色條件（如溫度、時間等）。
7、樣本前處理：對樣本進行適當?shù)臐饪s、純化等前處理步驟，以提高抗原的濃度。
8、降低檢測背景：通過更嚴格的洗滌步驟，減少非特異性結合導致的背景信號。
9、采用信號放大技術：例如使用生物素 - 親和素系統(tǒng)等方法來放大檢測信號。