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退火溫度是PCR反應(yīng)中的重要影響因素
閱讀：21849 發(fā)布時(shí)間：2021-8-3
PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）是一種在體外特異性擴(kuò)增靶DNA序列的的技術(shù)，通過多個(gè)循環(huán)的變性、退火和延伸，能夠使微量的遺傳物質(zhì)在幾小時(shí)內(nèi)得到幾百萬倍的擴(kuò)增。其基本過程為變性、退火和延伸，這三步需要不同的溫度條件。
那么，怎樣確定退火溫度？
退火溫度主要取決于引物的堿基組成、長度和濃度。而合適的退火溫度對(duì)PCR反應(yīng)的特異性尤為關(guān)鍵。一般來說，退火溫度的高低影響同時(shí)影響PCR反應(yīng)的特異性和靈敏性（擴(kuò)增效率），且兩者呈負(fù)相關(guān)，即較低的退火溫度可提高PCR反應(yīng)的靈敏性但其特異性較差，而較高的退火溫度則可以提高反應(yīng)的特異性但卻降低了其擴(kuò)增效率。
通常，在Tm值允許范圍內(nèi)選擇偏高的退火溫度以提高PCR反應(yīng)的特異性。當(dāng)然，實(shí)際的退火溫度還是要以對(duì)應(yīng)的PCR反應(yīng)的要求做出調(diào)整。
事實(shí)上，根據(jù)退火溫度的文字性定義可以看出，退火溫度的設(shè)定與引物的Tm值(熔解溫度)有一定的關(guān)系。因此大多數(shù)童鞋在設(shè)定退火溫度時(shí)，會(huì)以兩條引物中較低的Tm值再減去5℃。
而對(duì)于Tm值的確定，又是一個(gè)問題。商品化的引物會(huì)有一個(gè)建議的Tm值，而自己合成的Tm值需要進(jìn)行計(jì)算，可以通過引物設(shè)計(jì)軟件（primer premier 5.0，Oligo 6.22等）或在線的引物設(shè)計(jì)網(wǎng)站進(jìn)行Tm值的確定。但由于計(jì)算方法的不同，同樣一段引物在不同引物設(shè)計(jì)軟件或網(wǎng)站得到的Tm值有所差別。
種種以上，我們不難看出一個(gè)合適的退火溫度并不好確定。因此，優(yōu)化退火溫度理想的方法是設(shè)置一系列的對(duì)照反應(yīng)，即通過在低于計(jì)算出的引物Tm值2~10℃的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行退火的一系列平行反應(yīng)來確定退火溫度。
溫度梯度PCR儀是在普通PCR儀基礎(chǔ)上帶有設(shè)置溫度梯度功能的PCR儀，梯度PCR儀除具有普通PCR儀的結(jié)構(gòu)外，還具有特殊的梯度模塊，可實(shí)現(xiàn)對(duì)梯度溫度和梯度時(shí)間等參數(shù)的調(diào)整。因此可以在一次實(shí)驗(yàn)中對(duì)不同樣品設(shè)置不同的退火溫度和退火時(shí)間，從而可在短時(shí)間內(nèi)對(duì)PCR實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化，提高PCR科研效率。