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細(xì)胞計(jì)數(shù)方法存在的問(wèn)題與解決辦法
1. 細(xì)胞計(jì)數(shù)的意義
計(jì)數(shù)細(xì)胞是了解細(xì)胞數(shù)量變化的基本方法，細(xì)胞數(shù)量變化是細(xì)胞生理功能表現(xiàn)的重要指標(biāo)，準(zhǔn)確的細(xì)胞數(shù)量變化提供準(zhǔn)確的功能信息，錯(cuò)誤的細(xì)胞數(shù)量變化提供錯(cuò)誤的功能信息。所以細(xì)胞計(jì)數(shù)準(zhǔn)確性決定細(xì)胞生理學(xué)研究的成功與失敗。
2. 細(xì)胞計(jì)數(shù)要解決的問(wèn)題
細(xì)胞計(jì)數(shù)的目的是確定細(xì)胞樣本中的細(xì)胞數(shù)量，一般是指單位體積內(nèi)的細(xì)胞數(shù)量，如1升血樣本中含有多少個(gè)紅細(xì)胞，多少個(gè)白細(xì)胞；細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)經(jīng)常需要比較細(xì)胞處理前后的數(shù)量變化。計(jì)數(shù)細(xì)胞就是確定細(xì)胞樣本處理前后每單位樣本中含有多少個(gè)細(xì)胞，即單位體積內(nèi)的細(xì)胞數(shù)。
3. 現(xiàn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)儀器和計(jì)數(shù)方法存在的問(wèn)題
現(xiàn)在計(jì)數(shù)細(xì)胞的儀器和方法不少，但計(jì)數(shù)準(zhǔn)確度都不高，達(dá)不到細(xì)胞學(xué)研究要求的水平。原因出在細(xì)胞計(jì)數(shù)儀設(shè)計(jì)師對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)的目的要求和細(xì)胞計(jì)數(shù)操作過(guò)程，認(rèn)識(shí)不夠清楚，設(shè)計(jì)的儀器結(jié)構(gòu)原理有問(wèn)題。以細(xì)胞計(jì)數(shù)板為例，細(xì)胞計(jì)數(shù)板的結(jié)構(gòu)不太合理。細(xì)胞計(jì)數(shù)板的結(jié)構(gòu)是在一片玻璃板上蝕刻出一個(gè)細(xì)胞計(jì)數(shù)池，呈方形，邊長(zhǎng)1mm,深度0.1mm，容積是0.1mm3=0.1微升=萬(wàn)分之一毫升，底面用線分割成方格。計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)的細(xì)胞數(shù)準(zhǔn)確度沒(méi)有問(wèn)題，刻蝕的容積也沒(méi)有問(wèn)題，問(wèn)題出在使用方法。細(xì)胞計(jì)數(shù)的時(shí)候，計(jì)數(shù)池上面加了一個(gè)蓋玻片，細(xì)胞樣本是從計(jì)數(shù)板與蓋玻片之間的縫隙中加進(jìn)去的。細(xì)胞液充滿計(jì)數(shù)池和計(jì)數(shù)池與蓋玻片之間的空隙，這個(gè)空隙中的細(xì)胞也進(jìn)入計(jì)數(shù)池。因此計(jì)數(shù)的細(xì)胞體積應(yīng)該是計(jì)數(shù)池的體積加上空隙體積?？障扼w積是多大，不知道，計(jì)算細(xì)胞密度的時(shí)候都不計(jì)算內(nèi)，被忽略掉了，所以細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)的細(xì)胞密度不準(zhǔn)確。縫隙體積很小，但相對(duì)于只有0.1微升的計(jì)數(shù)池體積，影響是很大的，可能達(dá)到15%或更大，所以是不可以忽略掉的。計(jì)數(shù)池容積太小和加蓋玻片是細(xì)胞計(jì)數(shù)板的致命傷。
細(xì)胞計(jì)數(shù)板是細(xì)胞計(jì)數(shù)方法，優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)單、方便，計(jì)數(shù)細(xì)胞真實(shí)，數(shù)量準(zhǔn)確。缺點(diǎn)是計(jì)量體積不準(zhǔn)確，計(jì)數(shù)結(jié)果不準(zhǔn)確，另外計(jì)數(shù)的細(xì)胞無(wú)法回收使用和細(xì)胞數(shù)量少于10萬(wàn)的樣本無(wú)法計(jì)數(shù)也是問(wèn)題。
細(xì)胞自動(dòng)計(jì)數(shù)分析儀(Cellometer )是最近推出來(lái)的細(xì)胞計(jì)數(shù)方法。Cellometer的問(wèn)題比較大。Cellometer是基于圖像分析的細(xì)胞計(jì)數(shù)儀。計(jì)數(shù)原理類似與血球計(jì)數(shù)板，只是用儀器攝像代替人眼觀察細(xì)胞計(jì)數(shù)。加20ml樣本到計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)板的樣品室內(nèi)，使細(xì)胞平鋪為單層細(xì)胞，將計(jì)數(shù)板放入計(jì)數(shù)儀內(nèi)，通過(guò)儀器攝像頭選擇一個(gè)視野，記錄視野內(nèi)的細(xì)胞。該儀器的細(xì)胞計(jì)數(shù)方法沒(méi)有記錄樣品室內(nèi)的全部細(xì)胞，只是選取樣品室內(nèi)細(xì)胞分布的一個(gè)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)。儀器設(shè)定的視野面積近似于血球計(jì)數(shù)板一個(gè)白細(xì)胞計(jì)數(shù)單位的面積，沒(méi)有考慮樣品深度，而且顯微鏡視野面積受放大倍數(shù)影響，面積和深度都不確定，體積更是問(wèn)題，體積不準(zhǔn)確，計(jì)數(shù)出來(lái)的細(xì)胞濃度不會(huì)準(zhǔn)確。因此Cellometer細(xì)胞計(jì)數(shù)方法可信度很低。
流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀，以B.Dtc20-automated-cell-counter 為例，是臨床醫(yī)學(xué)應(yīng)用比較多的細(xì)胞計(jì)數(shù)方法。這是一種基于庫(kù)爾特原理的細(xì)胞計(jì)數(shù)儀。庫(kù)爾特原理認(rèn)為，懸浮在電解液中的顆粒隨電解液通過(guò)小孔管時(shí)，取代相同體積電解液，導(dǎo)致小孔管內(nèi)外兩電極間電阻發(fā)生瞬時(shí)變化，產(chǎn)生電位脈沖，脈沖信號(hào)的大小和次數(shù)與顆粒的大小和數(shù)目成正比。這類細(xì)胞計(jì)數(shù)儀是根據(jù)細(xì)胞通過(guò)小孔引起電位變化計(jì)算細(xì)胞個(gè)數(shù)。儀器根據(jù)細(xì)胞體積大小設(shè)定脈沖信號(hào)上下限，在上下限之間的顆粒信號(hào)作為細(xì)胞記錄，大于上限和小于下限的顆粒信號(hào)不作為細(xì)胞記錄，與顆粒的顏色、形狀、性質(zhì)無(wú)關(guān)。這種計(jì)數(shù)方法不能區(qū)分細(xì)胞與非細(xì)胞顆粒，體積與細(xì)胞大小相同的非細(xì)胞顆粒也作為細(xì)胞記錄下來(lái)，非細(xì)胞顆粒造成假陽(yáng)性細(xì)胞，大于和小于設(shè)定孔徑的細(xì)胞不作細(xì)胞計(jì)數(shù)造成假陰性。這類細(xì)胞計(jì)數(shù)儀的優(yōu)點(diǎn)是，自動(dòng)化程度高，快速方便，樣本體積計(jì)量準(zhǔn)確；主要問(wèn)題是存在假陽(yáng)性和假陰性問(wèn)題，誤差比較大，計(jì)數(shù)的細(xì)胞密度準(zhǔn)確度或真實(shí)性不高，而且檢測(cè)的細(xì)胞數(shù)量不能太少，細(xì)胞不能回收使用。該方法用于臨床檢驗(yàn)（要求準(zhǔn)確度不高）還可以，但不適合細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)。
4. 細(xì)胞計(jì)數(shù)問(wèn)題的解決辦法
上面介紹的三種類型細(xì)胞計(jì)數(shù)方法，涵蓋了現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域細(xì)胞計(jì)數(shù)的基本技術(shù)和方法。細(xì)胞計(jì)數(shù)是要獲得一個(gè)準(zhǔn)確的細(xì)胞密度。細(xì)胞密度是單位體積內(nèi)的細(xì)胞數(shù)量。計(jì)數(shù)細(xì)胞樣本的體積準(zhǔn)確，細(xì)胞數(shù)準(zhǔn)確，密度才會(huì)準(zhǔn)確。三種細(xì)胞計(jì)數(shù)方法，要么計(jì)數(shù)樣本體積不準(zhǔn)確（血球計(jì)數(shù)板，自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀），要么細(xì)胞計(jì)數(shù)不準(zhǔn)確（流式細(xì)胞儀），所以細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果都不夠準(zhǔn)確。