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PCR工作機(jī)制及高級使用
閱讀：838 發(fā)布時間：2023-8-10
PCR的工作機(jī)制
PCR由一系列復(fù)雜的化學(xué)反應(yīng)，包含前、中、后三個階段。最重要的化學(xué)變化是熱循環(huán)期間的產(chǎn)物合成。每次循環(huán)后產(chǎn)物、模板、聚合酶、引物和脫氧核苷酸的余量都會改變，處于連續(xù)的不穩(wěn)定狀態(tài)。所有的循環(huán)都是從模板和先前產(chǎn)物的變性開始。當(dāng)溫度較低時，引物退火到模板上。
早先若干循環(huán)的退火步驟要求引物尋找正確的染色體模板作為它們的目標(biāo)。在中期的循環(huán)中，先前合成的產(chǎn)物優(yōu)先成為模板。最后幾個循環(huán)中，增擴(kuò)后的高濃度產(chǎn)物互相雜交，由此阻止與引物的雜交。
引物退火后，Taq DNA聚合酶把自己定位到引物和模板綜合體上，提取介質(zhì)中的自由dNTPs然后沿著模板延伸。從本質(zhì)上講，引物和模板的任何反應(yīng)都會造成產(chǎn)物擴(kuò)展，它們的特異性在最初的幾個循環(huán)中可能很難控制，得到非特異性產(chǎn)物的摩爾量超過在模板上正確退火位置的量。PCR反應(yīng)特異性的可靠度依賴于2個引物必須定位到互補(bǔ)的DNA鏈上。進(jìn)一步講，退火溫度和Mg2+離子的濃度影響引物穩(wěn)定的雜交到模板上，雜交位置間距應(yīng)小于10kb。
相比之下，增擴(kuò)階段的大部分循環(huán)里，模板被很好的與先前增擴(kuò)的片段區(qū)分開。這些片段的數(shù)量取決于早先若干個循環(huán)的嚴(yán)密性。甄選同源性引物的退火位置是較簡單的，增擴(kuò)期間由染色體DNA貢獻(xiàn)的有效的模板數(shù)量只是可以忽略一小部分。甄選的復(fù)雜性被超量由引物從互補(bǔ)位點(diǎn)新增擴(kuò)的片段所降低。
PCR的化學(xué)計量
熱力學(xué)方面的影響對PCR來講是試劑濃度和模板間的對應(yīng)關(guān)系。在起先的循環(huán)中PCR試劑的摩爾比率是最高的，隨著PCR產(chǎn)物的增加而降低。令人驚訝的是這種減低是由增擴(kuò)的目標(biāo)分子的增加引起的而不是由于試劑的消耗。最初剩余的引物和脫氧核苷酸與模板的比率是固定的，反應(yīng)結(jié)束后，dNTP的濃度下降超過1倍，引物任然剩余95%，Taq DNA聚合酶沒有變化。增擴(kuò)千萬倍目標(biāo)分子后，模板分子遠(yuǎn)多于酶分子。當(dāng)產(chǎn)物增加后，酶全部被占用了，引物和模板的比率減低，推動自身退火。當(dāng)自身退火的數(shù)量增加或酶的總量有時，反應(yīng)處于飽狀態(tài)并停止指數(shù)級的增長。增擴(kuò)階段是自我受限的。這個階段之后，熱循環(huán)轉(zhuǎn)向未在最初幾個循環(huán)中被選擇的欺騙性的目標(biāo)增擴(kuò)，盡管能夠通過提高開始時Taq DNA聚合酶和引物的含量來維持高試劑比率，但這種修改很可能引起丟失特異性因?yàn)橐飼鷣y雜交，出現(xiàn)額外的條帶和斑點(diǎn)。
熱啟動（hot start）PCR
用于引物設(shè)計的位點(diǎn)因?yàn)檫z傳元件的定位而受時，如site-directed突變、表達(dá)克隆或用于DNA工程的遺傳元件的構(gòu)建和操作，熱啟動PCR對提高PCR特異性尤為有效。 盡管Taq DNA聚合酶的最佳延伸溫度在72℃，聚合酶在室溫仍然有活性。因此，在PCR配制過程中，熱循環(huán)剛開始，以及保溫溫度低于退火溫度時會產(chǎn)生非特異性的產(chǎn)物。這些非特異性產(chǎn)物一旦形成，就會被有效擴(kuò)增。
限制Taq DNA聚合酶活性的常用方法是在冰上配制PCR反應(yīng)液，并將其置于預(yù)熱的PCR儀。這種方法簡單便宜，但并不能完成抑制酶的活性，無法全消除非特異性產(chǎn)物的擴(kuò)增。熱啟動通過抑制DNA合成，直到PCR儀達(dá)到變性溫度。方法包括延緩加入Taq DNA聚合酶，在反應(yīng)體系達(dá)到90度時，暫停并保持溫度在70度以上。手工加入聚合酶，這個方法過于煩瑣， 尤其是對高通量應(yīng)用容易造成污染。其他的熱啟動方法使用蠟防護(hù)層將一種基本成分如鎂離子、酶、模板、緩沖液包裹起來，物理地分隔開。熱循環(huán)開始后，因蠟熔化而把各種成分釋放出來并混合在一起。蠟防護(hù)層法與手動熱啟動法一樣比較煩瑣，易受污染，不適用于高通量應(yīng)用。
還有一種方法是使用inactive DNA Polymerase. polymerase被抗體抑制失活，當(dāng)變性溫度超過70度時，抗體也變性了，這樣polymerase又被激活了。
Booster PCR
整個PCR反應(yīng)過程中引物前后擔(dān)任2種功能，篩選探針和增擴(kuò)引導(dǎo)。在最初的幾個熱循環(huán)期間，每個引物作為探針獨(dú)立地活動，篩選所有目標(biāo)。如果一對引物與目標(biāo)雜交，方向和位置都正確，就意味著目標(biāo)選擇的工作完成了。接下來在以后的循環(huán)中這對引物引導(dǎo)增擴(kuò)反應(yīng)。
增擴(kuò)低濃度的模板（等于或小于100個模板）比如單個細(xì)胞，石蠟化的組織有不同的特點(diǎn)。篩選階段相對于模板而言要有更多剩余的試劑。稀釋的模板造成難以篩選，因?yàn)橐锖湍０逑嘤龊皖l率被大大的降低了。這種情況更有可能引起引物之間形成二聚體。Booster PCR是解決這個問題的方法。在此步驟中，第一個循環(huán)階段使用稀釋后的引物和模板取得固定的引物/模板比例，大約在107:1。以確保開始擴(kuò)增時的準(zhǔn)確性，在增擴(kuò)階段提高引物的濃度到正常水品。
嵌套的引物
如果增擴(kuò)出的DNA序列嵌套存在于引物退火位置之間，從大范圍看增擴(kuò)出的目標(biāo)是同源的。引物雜交的嚴(yán)密性在最初若干個循環(huán)里是寬松的，允許較高的錯配偏差。這個效果能通過低于計算得到引物退火溫度來達(dá)到。第二步選擇明確的產(chǎn)物，嚴(yán)謹(jǐn)?shù)剡x擇一條已知染色體片段用來增擴(kuò)。簡單點(diǎn)說就是設(shè)計兩對引物, 一對是長的，另一對短的是包含在長引物內(nèi)的，用長引物擴(kuò)增的產(chǎn)物作為第二次擴(kuò)增的模板，這樣可以增加產(chǎn)物的量而且可以減少非特異性帶和錯配的情況.
假陰性
PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有①模板核酸的制備，②引物的質(zhì)量與特異性，③酶的質(zhì)量， ④PCR循環(huán)條件。尋找原因亦應(yīng)針對上述環(huán)節(jié)進(jìn)行分析研究。
模板：①模板中含有雜蛋白質(zhì)，②模板中含有Taq酶抑制劑，③模板中蛋白質(zhì)沒有消化除凈，特別是染色體中的組蛋白，④在提取制備模板時丟失過多，或吸入酚。⑤模板核酸變性不底。在酶和引物質(zhì)量好時，不出現(xiàn)擴(kuò)增帶，極有可能是標(biāo)本的消化處理，模板核酸提取過程出了毛病，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液，其程序亦應(yīng)固定不宜隨意更改。
酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時使用，以分析是否因?yàn)槊傅幕钚詥适Щ虿粔蚨鴮?dǎo)致假陰性。需注意的是有時PCR時忘了加Taq酶或電泳時忘了加溴化乙錠。
引物：引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱，是PCR失敗或擴(kuò)增條帶不理想、容易彌散的常見原因。有些批號的引物合成質(zhì)量有問題，兩條引物一條濃度高，一條濃度低，造成低效率的不對稱擴(kuò)增，對策為：①選定一個好的引物合成單位。②引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現(xiàn)，而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無條帶，此時做PCR有可能失敗，應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時要平衡其濃度。③引物使用過程中應(yīng)高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分，導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失效。④引物設(shè)計不合理，如引物長度不夠，引物之間形成二聚體等。