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電動(dòng)移液器對(duì)PCR準(zhǔn)確度的影響
摘要
定量聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR）分析具有高靈敏度，這是其成功并廣泛應(yīng)用于科學(xué)實(shí)驗(yàn)室的最重要原因之一。然而，包括移液技術(shù)在內(nèi)的許多因素都會(huì)對(duì)qPCR分析的結(jié)果產(chǎn)生影響。PCR Master Mix 通常在qPCR準(zhǔn)備期間使用，但可能很難對(duì)其進(jìn)行準(zhǔn)確移液。在本研究中，我們測(cè)試了在qPCR中使用電動(dòng)移液器移取Master Mix。研究證明，使用電動(dòng)移液器搭配低吸附濾芯吸頭或標(biāo)準(zhǔn)濾芯吸頭對(duì)Master Mix移液，可獲得良好的精準(zhǔn)性，并能確保移液速度及結(jié)果的重現(xiàn)性。從而得出結(jié)論，在進(jìn)行基于PCR的分析時(shí)，使用電動(dòng)移液器移取Master Mix確保得到可重復(fù)且可靠的結(jié)果。
引言
基于PCR的應(yīng)用已成為生物制藥工藝、臨床診斷和學(xué)術(shù)研究的關(guān)鍵手段。然而，在執(zhí)行定量聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR）時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可變性可能是個(gè)問題，移液誤差是需要重點(diǎn)關(guān)注的變化來源之一。在qPCR準(zhǔn)備階段，對(duì)Master Mix試劑進(jìn)行移液具有挑戰(zhàn)性。Master Mix通常由聚合酶、dNTP、MgCl2以及可能含吐溫和甘油成分的緩沖液組成。
本應(yīng)用說明的目的是測(cè)試在PCR分析應(yīng)用中使用電動(dòng)移液器移取Master Mix的可靠性。在定量PCR準(zhǔn)備階段，使用電動(dòng)移液器搭配低吸附濾芯吸頭來移取Master Mix，實(shí)驗(yàn)結(jié)果（定量循環(huán)，Cq）由準(zhǔn)確度和精準(zhǔn)度（重現(xiàn)性）來進(jìn)行評(píng)價(jià)。
方法
移液器和移液器吸頭選擇
使用Picus®電動(dòng)移液器、Safetyspace低吸附濾芯吸頭和濾芯吸頭。Picus®使用多次分液模式。移取Master Mix時(shí)，將電動(dòng)移液器速度參數(shù)設(shè)置為1。
qPCR準(zhǔn)備
qPCR準(zhǔn)備階段使用Picus®電動(dòng)移液器、Safetyspace濾芯吸頭及低吸附濾芯吸頭。Lo-Bind EP管用于DNA樣品制備及Master Mix的制備。制備用于所有測(cè)試的PCR Master Mix儲(chǔ)備液使用了MaximaSYBR Green qPCR Master Mix（不含ROX）、大腸桿菌uidA基因引物以及無核酸酶水。
用移液器將八個(gè) 15μL 的Master Mix重復(fù)樣品移取至PCR板孔中，用于各種測(cè)試條件。無模板對(duì)照（NTC）樣品不含大腸桿菌基因組DNA，并加入 5μL 無核酸酶水。用類似方法移取 5μL 含有1×106、1×105、1×104、1×103 以及1×102 個(gè)拷貝丨反應(yīng)大腸桿菌gDNA的系列稀釋標(biāo)準(zhǔn)品。
在每個(gè)測(cè)試孔中有 5μL 含有1×103 個(gè)拷貝丨反應(yīng)的大腸桿菌gDNA。使用Picus® 電動(dòng)移液器的多次分液功能及低吸附濾芯吸頭以相同的方式將所有DNA樣本添加到PCR管中。使用LightCycler®480 qPCR儀進(jìn)行qPCR。循環(huán)參數(shù)如下：在 95°C下預(yù)培養(yǎng) 10 分鐘，隨后在 95°C 10 秒、55°C 10 秒、75°C 15 秒，75°C延伸 10 秒，40 次循環(huán)。
對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品、對(duì)照品和樣品中的SYBR綠色熒光激發(fā)進(jìn)行定量。使用LightCycler® 480軟件確定定量循環(huán)（Cq）值和實(shí)際拷貝數(shù)，并使用MS Excel分析結(jié)果。
數(shù)據(jù)分析
Cq值的百分比系統(tǒng)誤差（%S）反映了處理Master Mix的儀器系統(tǒng)（移液器和吸頭系統(tǒng)）Cq值的誤差。移液過程中的隨機(jī)誤差是結(jié)果精準(zhǔn)度的測(cè)量，反映了實(shí)驗(yàn)中重復(fù)樣品之間的差異。Cq值的百分比隨機(jī)誤差（%R）反映了結(jié)果的重現(xiàn)性，并且可能受到實(shí)驗(yàn)人員移液操作的影響。