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PCR中各種熱啟動(dòng)酶存在的意義
各種熱啟動(dòng)酶存在的意義
市場上熱啟動(dòng)的酶種類很多，但新手并不了解熱啟動(dòng)酶存在的意義。
非熱啟動(dòng)的Taq酶在較低溫度時(shí)也有活性：我有一本1992年出版的《PCR基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)操作手冊》中提到，酶在70度時(shí)的合成速度為60核苷/秒/酶分子，55度時(shí)為22，37度時(shí)為1.5，22度時(shí)為0.25。也就是說此時(shí)引物還沒有正常配對(duì)（其可能錯(cuò)誤配對(duì)），而酶已經(jīng)開始合成了，其合成的產(chǎn)物就會(huì)成為以后擴(kuò)增中的非特異模板。
則熱啟動(dòng)酶只有在95度高溫一段時(shí)間后，其酶活動(dòng)才啟動(dòng)起來，故名：熱啟動(dòng)酶。
這也是為什么進(jìn)行PCR反應(yīng)加樣時(shí)，各種試劑要在低溫下加樣。但是不是在進(jìn)行PCR反應(yīng)加樣時(shí)維持低溫就不需要熱啟動(dòng)酶了呢？答案是也不盡然。
一般PCR儀在運(yùn)行開始后熱蓋加熱過程中，模板溫度是不控制的。由于熱蓋的加熱需要1.5分鐘以上，且熱蓋溫度一般設(shè)在105度，必然會(huì)引起模塊溫度的上升，一般會(huì)到30-35度，環(huán)境溫度高時(shí)更甚。也就是說設(shè)計(jì)不完備的儀器也會(huì)提高非特異性反應(yīng)。
有些儀器的熱蓋在開機(jī)時(shí)就啟動(dòng)，這樣做有可以廣場燙手且用戶開機(jī)后立即啟動(dòng)PCR程序也會(huì)造成非特異性反應(yīng)。東勝龍811PCR儀的解決辦法是在運(yùn)行開始后熱蓋加熱過程中迅速將模塊降溫到10度左右。熱蓋溫度到達(dá)后啟動(dòng)程序運(yùn)行。