您好, 歡迎來到化工儀器網(wǎng)
產(chǎn)品分類品牌分類
-
混勻儀|混合器 氣體發(fā)生器 分光測(cè)色計(jì) 勻漿機(jī) 研磨機(jī) 超凈工作臺(tái) 洗板機(jī) 高低溫試驗(yàn)箱 恒溫金屬浴 電阻爐 溶劑過濾器 漩渦混合儀|旋渦混勻儀 均質(zhì)器 水槽 恒溫水槽 手套 培養(yǎng)板 生物安全柜 天平 滴定管 瓶口分液器 光澤儀 錐入度儀 濁度計(jì) 分析儀 冷藏保存箱 色差儀 超純水機(jī) 預(yù)制冷槽 油浴槽 冷卻水循環(huán)裝置 溶媒回收裝置 恒溫水浴槽 液氮罐 馬弗爐 酶標(biāo)儀 培養(yǎng)箱 電泳儀 潔凈工作臺(tái) 干燥箱 磁力攪拌器 滅菌器 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 低溫冰箱 防爆冰箱 離心機(jī) 振蕩器 移液器 真空泵
常用蛋白質(zhì)濃度測(cè)定方法匯總
常用蛋白質(zhì)濃度測(cè)定方法匯總
蛋白質(zhì)是細(xì)胞中最重要的含氮生物大分子之一，承擔(dān)著各種生物功能。蛋白質(zhì)的定量分析是蛋白質(zhì)構(gòu)造分析的基礎(chǔ)。目前常用的蛋白測(cè)量的方法主要有BCA法、考馬斯亮藍(lán)法(Bradford)和Lowry法等。
BCA法
原理
在堿性環(huán)境下蛋白質(zhì)與Cu2+絡(luò)合并將Cu2+還原成Cu1+(biuret reaction)。BCA與Cu1+結(jié)合形成穩(wěn)定的紫藍(lán)色復(fù)合物，在562nm處有高的光吸收值并與蛋白質(zhì)濃度成正比，據(jù)此可測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。
實(shí)驗(yàn)步驟
1.按試劑盒說明書配置BCA工作液；
2.完溶解蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品，加到96孔板的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品孔中，按照說明書要求對(duì)標(biāo)品進(jìn)行梯度稀釋，加入BCA工作液，用酶標(biāo)儀測(cè)定其吸光度；
3.以樣品濃度為X軸，吸光度為Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；
4.待測(cè)樣品中加入BCA工作液，測(cè)定吸光度，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，計(jì)算樣品濃度。
與Lowery法相比，BCA蛋白測(cè)定方法靈敏度高，操作簡(jiǎn)單，試劑及其形成的顏色復(fù)合物穩(wěn)定性俱佳，并且受干擾物質(zhì)影響小。與Bradford法相比，BCA法的顯著優(yōu)點(diǎn)是不受去垢劑的影響。
考馬斯亮藍(lán)法(Bradford)法
原理
考馬斯亮藍(lán)G-250(Coomassie brilliant blue G-250)測(cè)定蛋白質(zhì)含量屬于染料結(jié)合法的一種。在游離狀態(tài)下呈紅色，最大光吸收在488nm;當(dāng)它與蛋白質(zhì)結(jié)合后變?yōu)榍嗌?，蛋白質(zhì)-色素結(jié)合物在595nm波長(zhǎng)下有最大光吸收。其光吸收值與蛋白質(zhì)含量成正比，因此可用于蛋白質(zhì)的定量測(cè)定，是一種常用的微量蛋白質(zhì)快速測(cè)定方法。
實(shí)驗(yàn)步驟
1.按試劑盒說明書配置Bradford染液；
2.全溶解蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品，加到96孔板的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品孔中，按照說明書要求對(duì)標(biāo)品進(jìn)行梯度稀釋，加入染液和染料結(jié)合液后，用酶標(biāo)儀測(cè)定其吸光度；
3.以標(biāo)品濃度為X軸，吸光度為Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；
4.各孔中加入染液和染料結(jié)合液，測(cè)定樣品吸光度，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，計(jì)算樣品濃度。
Bradford法試劑配制簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)便快捷，反應(yīng)非常靈敏，靈敏度比Lowry法還高4倍，可測(cè)定微克級(jí)蛋白質(zhì)含量，測(cè)定蛋白質(zhì)濃度范圍為0～1 000μg/mL，最小可測(cè)2.5μg/mL蛋白質(zhì)。
斐林—酚試劑(Lowry)法
原理
斐林(Folin)-酚試劑法結(jié)合了雙縮脲試劑和酚試劑與蛋白質(zhì)的反應(yīng)，其中包括兩步反應(yīng)：第一步是在堿性條件下，與銅試劑作用生成蛋白質(zhì)-銅絡(luò)合物;第二步是此絡(luò)合物將磷鉬酸、磷鎢酸試劑還原，生成磷鉬藍(lán)和磷鎢藍(lán)的深藍(lán)色混合物，顏色深淺與蛋白含量成正相關(guān)，在650nm波長(zhǎng)下有最大光吸收。
實(shí)驗(yàn)步驟
與上述兩種方法大致相同
LORRY法靈敏度高,重復(fù)性好，適于5～l00μg蛋白質(zhì)的定量，耗時(shí)長(zhǎng)，操作要嚴(yán)格計(jì)時(shí)，在實(shí)驗(yàn)中要特別注意排除還原物質(zhì)、檸檬酸等的干擾作用才能得到最準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
這幾種方法共同點(diǎn)在于，都需要繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，而標(biāo)準(zhǔn)曲線及待測(cè)樣品往往數(shù)量較多，為了縮短實(shí)驗(yàn)耗時(shí)，保證測(cè)量準(zhǔn)確性，可使用酶標(biāo)儀對(duì)吸光度進(jìn)行測(cè)定。