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酶標(biāo)儀在植物領(lǐng)域的三種應(yīng)用總結(jié)
一、簡介
在基于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的研究中，酶標(biāo)儀主要應(yīng)用于: (1) 常規(guī)分子檢測，如核酸、蛋白濃度及酶活性分析等；(2) 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)研究， 如一些細(xì)胞信號事件如 ROS，修飾的檢測；(3) 整體細(xì)胞水平的分析，如細(xì)胞的活力、凋亡和殺傷等。然而在植物領(lǐng)域中，酶標(biāo) 儀的應(yīng)用則偏向前兩個(gè)方向，此外，植物領(lǐng)域的酶標(biāo)儀應(yīng)用普遍度也不及動(dòng)物，但這并不限制酶標(biāo)儀在該領(lǐng)域的應(yīng)用前景。在此， 我們結(jié)合常見的應(yīng)用案例介紹酶標(biāo)儀在植物領(lǐng)域中的應(yīng)用，提升酶標(biāo)儀在植物研究中的應(yīng)用價(jià)值，并進(jìn)一步協(xié)助植物的科研發(fā)展。
二、利用酶標(biāo)儀進(jìn)行常見的分子檢測和分析
在植物領(lǐng)域中一些基礎(chǔ)的分子檢測，如基于紫外吸收或熒光的 DNA，RNA 和蛋白定量及純度分析等，都可以用酶標(biāo)儀進(jìn)行 高通量檢測。由于原理和應(yīng)用類型與研究哺乳動(dòng)物細(xì)胞類似，在此就不贅述了，大家有需求可參考我們針對核酸定量的應(yīng)用材料。 在此我們主要列植物領(lǐng)域中比較特色的幾個(gè)案例。
2.1 吸收峰和熒光光譜分析
植物領(lǐng)域中通常會(huì)涉及到對一些感興趣的化合物，如色素等的物理指標(biāo)分析，其中就包括吸收峰分析和針對具有熒光特質(zhì)的 化合物進(jìn)行熒光光譜分析。通常這些分析會(huì)由分光光度計(jì)完成，但會(huì)受到通量和曲線分析能力的限制?，F(xiàn)階段大部分 Molecular Devices 推出的配備光柵的酶標(biāo)儀如 M 系列和 iD 系列都支持出色的光譜掃描分析，包括全波長光吸收和熒光光譜掃描，步進(jìn)可精 確至 1 nm，可應(yīng)對常見的光譜分析需求，并極大提高通量。同時(shí)配備的 SoftMax Pro 軟件可自動(dòng)分析光譜圖簡化處理流程。
基于光譜掃描還可用于進(jìn)一步分析具有調(diào)節(jié)熒光能力的蛋白功能，如藍(lán)藻細(xì)菌中的 Orange Carotenoid Protein (OCP) 在強(qiáng) 藍(lán)-綠光下會(huì)和藻膽 ( 蛋白 ) 體 (PBS) 相互作用來保護(hù)細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)中可觀察到 OCP 的引入可降低 PBS 的熒光發(fā)射強(qiáng)度。對于新發(fā)現(xiàn) 的 OCP 家族成員，我們就可以通過熒光光譜掃描功能確認(rèn)其是否會(huì)淬滅 PBS 的熒光 ( 圖一 )。結(jié)果發(fā)現(xiàn)相較于已知的 OCP1，新 發(fā)現(xiàn)的 OCP2 具有較弱的熒光淬滅能力 ( 圖一，來源于文獻(xiàn) Nat Plants. 2017 Jul 10;3:17089. )。
三、利用酶標(biāo)儀進(jìn)行植物信號分析
除了一些常見分子的分析和定量之外，常見的植物信號，如報(bào)告基因、蛋白蛋白相互作用和 ROS 分析等，也都可以用酶標(biāo)儀 進(jìn)行高通量的分析。
3.1 報(bào)告基因分析
基于 β-葡萄苷酸酶 (β-glucuronidase) 的 GUS報(bào)告基因系統(tǒng)利用了在高等植物中 β-glucuronidase 表達(dá)和活性很低，是常見 的研究植物基因功能和活力的分析方法?；诓煌牡孜?，GUS 報(bào)告基因可用多種方法學(xué)進(jìn)行檢測，包括組織染色法、光吸收法 和熒光法。在此主要介紹可用于熒光酶標(biāo)儀分析的熒光法，其主要基于底物 MUG (4-methylumbelliferyl b-D-glucuronide)，其 在 GUS 的作用下產(chǎn)生具有熒光的 4-MU (4-methylumbelliferone)，可以進(jìn)一步用熒光酶標(biāo)儀進(jìn)行分析。在進(jìn)行熒光法 GUS 報(bào)告 基因檢測時(shí)，通常需要 4-MU 標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行校準(zhǔn)，同時(shí) GUS 的活性還需要進(jìn)一步使用總蛋白量來校準(zhǔn)。此外，4-MU 本身容易降解， 因此使用時(shí)注意保護(hù)和有效期。
熒光法 GUS 報(bào)告基因系統(tǒng)在植物研究中的應(yīng)用方向很多，其中包括特定的基因啟動(dòng)子活力在激素處理和壓力情況下的變化 ( 圖六，J Exp Bot. 2005 Mar;56(413):909-20. ) 和特定基因的過表達(dá)是否會(huì)影響靶基因啟動(dòng)子活力 ( 圖七，Mol Plant. 2012 Sep;5 (5):1042-57. ) 等。