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上海巴玖為您講解PCR技術(shù)的基礎(chǔ)原理
PCR技術(shù)的基本原理
原理
⑴PCR技術(shù)的基本原理：該技術(shù)是在模板DNA、引物和四種脫氧核糖核苷酸存在下，依賴于DNA聚合酶的酶促合成反應(yīng)。DNA聚合酶以單鏈DNA為模板，借助一小段雙鏈DNA來(lái)啟動(dòng)合成，通過(guò)一個(gè)或兩個(gè)人工合成的寡核苷酸引物與單鏈DNA模板中的一段互補(bǔ)序列結(jié)合，形成部分雙鏈。在適宜的溫度和環(huán)境下，DNA聚合酶將脫氧單核苷酸加到引物3´-OH末端，并以此為起始點(diǎn)，沿模板5´→3´方向延伸，合成一條新的DNA互補(bǔ)鏈。PCR反應(yīng)的基本成分包括：模板DNA(待擴(kuò)增DNA)、引物、4種脫氧核苷酸(dNTPs)、DNA聚合酶和適宜的緩沖液。類似于DNA的天然復(fù)制過(guò)程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。
PCR由變性--退火--延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：
①模板DNA的高溫變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；
②模板DNA與引物的低溫退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；
③引物的適溫延伸：DNA模板--引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈重復(fù)循環(huán)變性-退火-延伸三過(guò)程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需2～4分鐘， 2～3小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍。
⑵PCR的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)： PCR的三個(gè)反應(yīng)步驟反復(fù)進(jìn)行，使DNA擴(kuò)增量呈指數(shù)上升。反應(yīng)終的DNA 擴(kuò)增量可用Y＝(1＋X)n計(jì)算。Y代表DNA段擴(kuò)增后的拷貝數(shù)，X表示平(Y)均每次的擴(kuò)增效率，n代表循環(huán)次數(shù)。平均擴(kuò)增效率的理論值為100%，但在實(shí)際反應(yīng)中平均效率達(dá)不到理論值。 反應(yīng)初期，靶序列DNA段的增加呈指數(shù)形式，隨著PCR產(chǎn)物的逐漸積累，被擴(kuò)增的DNA 段不再呈指數(shù)增加，而進(jìn)入線性增長(zhǎng)期或靜止期， 即出現(xiàn)“停滯效應(yīng)” ，這種效應(yīng)稱平臺(tái)期數(shù)、PCR 擴(kuò)增效率及DNA聚合酶PCR的種類和活性及非特異性產(chǎn)物的竟?fàn)幍纫蛩?。大多?shù)情況下，平臺(tái)期的到來(lái)是不可避免的。
⑶PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 ：可分為長(zhǎng)產(chǎn)物片段和短產(chǎn)物片段兩部分。短產(chǎn)物片段的長(zhǎng)度嚴(yán)格地限定在兩個(gè)引物鏈5'端之間，是需要擴(kuò)增的特定片段。短產(chǎn)物片段和長(zhǎng)產(chǎn)物片段是由于引物所結(jié)合的模板不一樣而形成的，以一個(gè)原始模板為例，在一個(gè)反應(yīng)周期中， 以兩條互補(bǔ)的DNA為模板，引物是從3'端開(kāi)始延伸， 其5'端是固定的，3' 端則沒(méi)有固定的止點(diǎn)，長(zhǎng)短不一，這就是“長(zhǎng)產(chǎn)物片段”。進(jìn)入第二周期后，引物除與原始模板結(jié)合外，還要同新合成的鏈(即“長(zhǎng)產(chǎn)物片段”)結(jié)合。引物在與新鏈結(jié)合時(shí)， 由于新鏈模板的5'端序列是固定的， 這就等于這次延伸的片段3'端被固定了止點(diǎn)， 保證了新片段的起點(diǎn)和止點(diǎn)都限定于引物擴(kuò)增序列以內(nèi)、形成長(zhǎng)短一致的“短產(chǎn)物片段”。不難看出“短產(chǎn)物片段”是按指數(shù)倍數(shù)增加， 而“長(zhǎng)產(chǎn)物片段”則以算術(shù)倍數(shù)增加， 幾乎可以忽略不計(jì)， 這使得PCR的反應(yīng)產(chǎn)物不需要再純化，就能保證足夠純DNA段供分析與檢測(cè)用