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上海巴玖講解光學(xué)顯微鏡之熒光觀察
熒光現(xiàn)象
熒光是指熒光物質(zhì)在特定波長光照射下，幾乎同時發(fā)射出波長更長光的過程(圖1)。當(dāng)特定波長(激發(fā)波長)的光照射一個分子(如熒光團(tuán)中的分子)時，光子能量被該分子的電子吸收。接著，電子從基態(tài)(S0)躍遷至較高的能級，即激發(fā)態(tài)(S1’)。這個過程稱為激發(fā)①。電子在激發(fā)態(tài)停留10-9–10-8秒，在此過程中電子損失一些能量②。電子離開激發(fā)態(tài)(S1)并回到基態(tài)的過程中③，會釋放出激發(fā)過程中吸收的剩余能量。
熒光雅布倫斯基圖
熒光分子在激發(fā)態(tài)駐留的時間為熒光壽命，一般為納秒級別，是熒光分子本身固有的特性。利用熒光壽命進(jìn)行成像的技術(shù)叫熒光壽命成像(Fluorescence Lifetime Imaging，F(xiàn)LIM)，可以在熒光強(qiáng)度成像之外，更加深入地進(jìn)行功能性測量，獲取分子構(gòu)象、分子間相互作用、分子所處微環(huán)境等常規(guī)光學(xué)成像難以獲得的信息。
熒光的另一個重要特性是Stokes位移，即激發(fā)峰和發(fā)射峰之間的波長差異（圖2）。通常發(fā)射光波長比激發(fā)光波長更長。這是由于熒光物質(zhì)被激發(fā)之后、釋放光子之前，電子經(jīng)過弛豫過程會損耗一部分能量。具有較大Stokes位移的熒光物質(zhì)更易于在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。
熒光顯微鏡
熒光顯微鏡是利用熒光特性進(jìn)行觀察、成像的光學(xué)顯微鏡，廣泛應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)、植物學(xué)、微生物學(xué)、病理學(xué)、遺傳學(xué)等各領(lǐng)域。熒光成像具有高靈敏度和高特異性的優(yōu)點(diǎn)，非常適合進(jìn)行特定蛋白、細(xì)胞器等在組織及細(xì)胞中的分布的觀察，共定位和相互作用的研究，離子濃度變化等生命動態(tài)過程的追蹤等等。
細(xì)胞中大部分分子不發(fā)熒光，想要觀察它們，進(jìn)行熒光標(biāo)記。熒光標(biāo)記的方法非常多，可以直接標(biāo)記（比如使用DAPI標(biāo)記DNA），或利用抗體抗原結(jié)合特性進(jìn)行免疫染色，也可以用熒光蛋白（如GFP，綠色熒光蛋白）標(biāo)記目標(biāo)蛋白，還可以用可逆結(jié)合的合成染料（如Fura-2）等。
倒置熒光顯微鏡MF53-N
目前熒光顯微鏡已成為各個實驗室及成像平臺的標(biāo)配成像設(shè)備，是我們?nèi)粘嶒灥暮脦褪帧晒怙@微鏡主要分為三大類：正置熒光顯微鏡（適合切片）、倒置熒光顯微鏡（適合活細(xì)胞，兼顧切片）、熒光體視鏡（適合較大標(biāo)本，如植物、斑馬魚（成體/胚胎）、青鳉、小鼠/大鼠器官等）。
熒光顯微成像技術(shù)應(yīng)用廣泛，種類豐富，而且新技術(shù)還在不斷涌現(xiàn)，大家可以選擇的技術(shù)去完成自己的研究。